雷雅娟，熊曄蓉，朱顏玥，段夢(mèng)茹，孫春萌，何東升，涂家生

(中國(guó)藥科大學(xué)藥學(xué)院，藥用輔料及仿創(chuàng)藥物研發(fā)評(píng)價(jià)中心，南京 210009)

泊洛沙姆(poloxamer)由環(huán)氧丙烷和丙二醇反應(yīng)，形成聚氧丙烯二醇，然后加入環(huán)氧乙烷形成嵌段共聚物，其商業(yè)化產(chǎn)品泊洛沙姆407的水溶液具有特殊的溫度敏感型原位凝膠性質(zhì)[1]。根據(jù)生產(chǎn)過(guò)程中環(huán)氧乙烷和環(huán)氧丙烷相對(duì)量的不同，其物理性質(zhì)和表面活性千差萬(wàn)別。泊洛沙姆188在藥物制劑領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，通常用作基質(zhì)、增溶劑、穩(wěn)定劑、乳化劑、吸收促進(jìn)劑、固體分散體載體等[2-5]，以控制藥物釋放，提高藥物的穩(wěn)定性，增加難溶性藥物的溶解度，因而嚴(yán)格控制泊洛沙姆188中有關(guān)雜質(zhì)種類(lèi)及限度具有重要意義。

在泊洛沙姆188的合成過(guò)程中，乙二醇為環(huán)氧乙烷的有關(guān)副產(chǎn)物，二甘醇、三甘醇為其次級(jí)副產(chǎn)物。乙二醇又名甘醇或1,2-亞乙基二醇，是一種多元醇溶劑，為無(wú)色無(wú)臭、有甜味液體，在肝臟內(nèi)80%通過(guò)乙醇脫氫酶代謝為幾種酸代謝物(乙醇酸、乙醛酸、草酸等)[6]。乙二醇對(duì)動(dòng)物有急性毒性，致死劑量約為1.4 mL/kg，其特征為中樞神經(jīng)系統(tǒng)抑制和人鼠代謝性酸中毒[7]。二甘醇和三甘醇為無(wú)色無(wú)臭、具吸濕性的黏稠液體，具一定刺激性，對(duì)腎臟和神經(jīng)系統(tǒng)均有毒性[8]。有研究表明，長(zhǎng)期使用含二甘醇的制劑能產(chǎn)生經(jīng)皮毒性并伴隨嚴(yán)重的急性腎功能損傷[9]。因此，常用藥用輔料泊洛沙姆188中乙二醇、二甘醇和三甘醇的檢測(cè)對(duì)于保證用藥安全有效，提高藥品質(zhì)量和安全性都具有重要意義。

《中華人民共和國(guó)藥典》(2015年版)[10]泊洛沙姆188質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中乙二醇、二甘醇檢查方法不夠完善，存在樣品配制方法不合理、樣品及對(duì)照品溶液濃度低于檢測(cè)限、高溫區(qū)保留時(shí)間過(guò)短等問(wèn)題。本研究對(duì)原有氣相色譜方法進(jìn)行優(yōu)化，并進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證[11-14]。同時(shí)，三甘醇為泊洛沙姆188生產(chǎn)中的次級(jí)副產(chǎn)物，從生產(chǎn)角度考慮，為嚴(yán)格控制原料有關(guān)雜質(zhì)種類(lèi)及限度，規(guī)范生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)，相較于現(xiàn)有各國(guó)藥典，本方法創(chuàng)新性地增加了三甘醇檢查，以提高藥用輔料質(zhì)量和安全性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法系統(tǒng)適應(yīng)性良好，精密度高，加樣回收率結(jié)果較好，適用于泊洛沙姆188中殘留雜質(zhì)乙二醇、二甘醇和三甘醇的測(cè)定，可為保證用藥安全有效，進(jìn)一步控制這3種雜質(zhì)的殘留量提供科學(xué)依據(jù)[15]。

1 材 料

1.1 藥品與試劑

泊洛沙姆188(南京威爾藥業(yè)股份有限公司，德國(guó)巴斯夫股份公司，湖北葛店人福藥業(yè)有限責(zé)任公司)；乙二醇標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)食品藥品檢定研究院)；二甘醇標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)食品藥品檢定研究院)；三甘醇、1,3-丁二醇、無(wú)水乙醇均為市售色譜級(jí)，其余試劑均為市售分析級(jí)。

1.2 儀 器

Trace 1300、Trace 1310氣相色譜儀(美國(guó)Thermo Fisher公司)；Omni-A超純水系統(tǒng)(廈門(mén)銳思捷科學(xué)儀器有限公司)；KQ-500E超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；BSA124S型、SECURA24-1CN型分析天平(德國(guó)Sartorius公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件及測(cè)定方法

色譜柱：Agilent，VF-17ms(30 m×0.53 mm，1.0 μm)，固定相為苯基-聚二甲基硅氧烷(50∶50)。起始溫度60 ℃，維持5 min，以10 ℃/min的速率升至100 ℃，再以4 ℃/min的速率升至170 ℃，最后以30 ℃/min的速率升至290 ℃，維持30 min。進(jìn)樣口溫度270 ℃，檢測(cè)器(FID)溫度290 ℃。分流進(jìn)樣，分流比10∶1，進(jìn)樣量1 μL。

取供試品溶液和對(duì)照品溶液注入氣相色譜儀，按內(nèi)標(biāo)法以峰面積計(jì)算。

2.2 溶液配制

2.2.1 內(nèi)標(biāo)溶液 取1,3-丁二醇適量，精密稱(chēng)定，用95%乙醇溶解并稀釋制成1 mL中含0.1 mg的溶液，搖勻，作為內(nèi)標(biāo)溶液。

2.2.2 對(duì)照品儲(chǔ)備溶液 取乙二醇、二甘醇、三甘醇適量，精密稱(chēng)定，用95%乙醇溶解并稀釋制成每1 mL中各含0.1 mg的混合溶液，搖勻，作為對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。

2.2.3 對(duì)照品溶液 精密移取對(duì)照品儲(chǔ)備溶液1 mL，置10 mL量瓶中，精密加內(nèi)標(biāo)溶液l mL，用95%乙醇稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。

2.2.4 供試品溶液 取本品1.0 g，精密稱(chēng)定，置10 mL量瓶中，精密加內(nèi)標(biāo)溶液1 mL，用95%乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

2.3 系統(tǒng)適應(yīng)性

取對(duì)照品溶液、供試品溶液按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，結(jié)果表明乙二醇、1,3-丁二醇、二甘醇、三甘醇間分離度均不小于2.0，理論塔板數(shù)均大于5 000，保留時(shí)間：乙二醇約為4.013 min，1,3-丁二醇約為8.543 min，二甘醇約為11.306 min，三甘醇約為19.437 min。

2.4 專(zhuān)屬性試驗(yàn)

專(zhuān)屬性要求空白溶劑對(duì)乙二醇、二甘醇、三甘醇的含量檢測(cè)均無(wú)干擾，空白溶劑為95%乙醇。取空白溶劑、對(duì)照品溶液、供試品溶液按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖(圖1)，結(jié)果表明空白溶劑對(duì)乙二醇、二甘醇、三甘醇含量檢測(cè)均無(wú)干擾。

Figure 1 Chromatograms of blank solution (A),reference solution (B) and test solution (C)

1:Ethylene glycol;2:1,3-Butanediol;3:Diethylene glycol;4:Triethylene glycol

2.5 檢測(cè)限與定量限

將對(duì)照品儲(chǔ)備溶液逐級(jí)稀釋至信噪比為S/N=10時(shí)的濃度，即為各樣品的定量限；信噪比為S/N=3時(shí)的濃度，即為樣品的檢測(cè)限。乙二醇、1,3-丁二醇、二甘醇、三甘醇對(duì)照品質(zhì)量濃度(μg/mL)分別為2.112，2.002，2.076時(shí)3種物質(zhì)信噪比均達(dá)3，達(dá)到檢測(cè)限；質(zhì)量濃度(μg/mL)分別為6.336，6.006，6.228時(shí)3種物質(zhì)信噪比均達(dá)10，達(dá)到定量限。

2.6 線(xiàn)性試驗(yàn)

分別精密移取對(duì)照品儲(chǔ)備溶液0.3，0.4，0.5，0.6，0.7 mL置于5 mL量瓶中，精密加入內(nèi)標(biāo)溶液0.5 mL，加95%乙醇定容至5 mL，搖勻，密封，作為1～5線(xiàn)性測(cè)試溶液。按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，各取樣點(diǎn)重復(fù)測(cè)定3次，根據(jù)目標(biāo)物質(zhì)峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比值進(jìn)行計(jì)算，所擬合線(xiàn)性回歸方程r>0.999，各取樣點(diǎn)RSD均不大于4.0%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

Table 1 Results of linearity test of three residual impurities (n=3)

Residual impurityLinear range/(μg/mL)Regression equationrEthylene glycol6.336-14.78y=0.065 9x-0.045 10.999 7Diethylene glycol6.006-14.01y=0.064 4x-0.042 90.999 5Triethylene glycol6.228-14.53y=0.067 4x-0.039 80.999 3

2.7 進(jìn)樣精密度

取對(duì)照品溶液按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣8次，根據(jù)目標(biāo)物質(zhì)峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比值進(jìn)行計(jì)算，乙二醇、二甘醇和三甘醇的RSD(%，n=8)分別為3.3、3.0和2.3，表明該方法精密度良好。

2.8 準(zhǔn)確度試驗(yàn)

準(zhǔn)確度指采用該方法測(cè)定的結(jié)果與真實(shí)值或參考值之間的接近程度，一般用回收率表示，選擇回收率溶液濃度為測(cè)定濃度的80%、100%和120%。取一批樣品(經(jīng)外標(biāo)法檢測(cè)，測(cè)本底值)約0.5 g，共9份分為3組(配制方法見(jiàn)表 2)，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，根據(jù)目標(biāo)物質(zhì)峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比值進(jìn)行計(jì)算，回收率均在85%～110%之間，RSD均小于4%，表明方法準(zhǔn)確度良好。具體結(jié)果見(jiàn)表3。

Table 2 Preparation method of recovery solution

GroupSample/gReference reserve solution/mL80%0.4100%0.50.5120%0.6Dilute to 5 mL with 95% ethanol

Table 3 Recovery of three residual impurities (n=9)

Residual impurityAverage recovery/%RSD/%Ethylene glycol99.052.9Diethylene glycol102.204.0Triethylene glycol101.913.1

2.9 樣品測(cè)定

取3個(gè)廠(chǎng)家各批次樣品按照“2.2”項(xiàng)下方法配制供試品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖，根據(jù)目標(biāo)物質(zhì)峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比值進(jìn)行計(jì)算，乙二醇、二甘醇和三甘醇均未達(dá)檢測(cè)限，表明3種雜質(zhì)殘留含量均符合規(guī)定。

3 討 論

3.1 溶劑及溶液配制方法

泊洛沙姆188樣品在無(wú)水乙醇中溶解性差，僅在長(zhǎng)時(shí)間超聲后溶解，且質(zhì)量濃度為100 mg/mL時(shí)溶液不穩(wěn)定，溶解后易析出，容易堵塞色譜柱；在95%乙醇中，泊洛沙姆188樣品無(wú)需超聲即可溶解，且溶液在低濃度時(shí)穩(wěn)定不易析出，因此改用95%乙醇作為溶劑。氣相色譜液體進(jìn)樣時(shí)僅要求進(jìn)樣溶液澄清透明，泊洛沙姆188樣品在95%乙醇中溶解性好，溶液澄清透明，因此供試品配制過(guò)程中無(wú)需濾過(guò)操作，以簡(jiǎn)化樣品配制過(guò)程。

3.2 進(jìn)樣方法

不分流進(jìn)樣時(shí)目標(biāo)峰與雜質(zhì)峰重合，分離度不足，雜質(zhì)峰較多，無(wú)法進(jìn)行定量計(jì)算。改為分流進(jìn)樣可以得到更好的峰形和分離效果，可進(jìn)行定量檢測(cè)。分流比為3∶1和5∶1時(shí)乙二醇與雜質(zhì)峰仍無(wú)法完全分離，因此改分流比為10∶1，分離度符合要求，對(duì)照均達(dá)定量限，雜質(zhì)峰明顯減少，有利于更好地進(jìn)行定量分析。

3.3 對(duì)照品溶液濃度

樣品及對(duì)照品溶液濃度過(guò)低時(shí)，廣泛使用的氣相檢測(cè)器在規(guī)定濃度無(wú)法達(dá)到檢測(cè)限。因此參照實(shí)驗(yàn)方法，對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度為10 μg/mL時(shí)，乙二醇、1,3-丁二醇、二甘醇和三甘醇均達(dá)定量限，信噪比大于10且峰型良好，因此將對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度設(shè)為10 μg/mL，樣品溶液質(zhì)量濃度設(shè)為100 mg/mL。

3.4 高溫區(qū)及保持時(shí)間

泊洛沙姆188為高分子化合物，殘留在色譜柱中易堵塞色譜柱，縮短其使用壽命甚至損壞色譜柱。原標(biāo)準(zhǔn)中采用的對(duì)照品及樣品濃度較低，泊洛沙姆188含量較少，高溫區(qū)僅保留2 min。更改實(shí)驗(yàn)方法后，泊洛沙姆188濃度提高，因此需要延長(zhǎng)高溫區(qū)保留時(shí)間，使高分子樣品完全氣化，以保護(hù)色譜柱。照原藥典方法，高溫區(qū)設(shè)置270 ℃時(shí)樣品雜質(zhì)無(wú)法完全氣化，產(chǎn)生的殘留影響下次進(jìn)樣，將溫度提高至290 ℃后雜質(zhì)殘留明顯改善，避免樣品間相互影響。

3.5 三甘醇含量的測(cè)定

環(huán)氧乙烷為泊洛沙姆188的主要合成原料，其水合后生成的乙二醇是其水合過(guò)程的主要副產(chǎn)物，占8%～9%；二甘醇、三甘醇為次級(jí)副產(chǎn)物，約占1%。因此在現(xiàn)行藥典標(biāo)準(zhǔn)檢查泊洛沙姆188中乙二醇與二甘醇?xì)埩艉康幕A(chǔ)上，增加三甘醇?xì)埩袅康臋z查，從生產(chǎn)安全角度考慮，嚴(yán)格控制原料有關(guān)雜質(zhì)種類(lèi)及限度，以提高藥品質(zhì)量和安全性。

4 小 結(jié)

本研究從制劑生產(chǎn)及用藥安全角度出發(fā)，為嚴(yán)格控制原料有關(guān)雜質(zhì)種類(lèi)及限度，規(guī)范生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)，在現(xiàn)行《中華人民共和國(guó)藥典》(2015年版)泊洛沙姆188質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，優(yōu)化了原檢測(cè)方法，增加了三甘醇的檢查。改進(jìn)后的方法可行性強(qiáng)，乙二醇、二甘醇和三甘醇分離度良好，對(duì)泊洛沙姆188生產(chǎn)及質(zhì)量控制具有重大意義，為保證用藥安全有效，進(jìn)一步控制這3種雜質(zhì)的殘留量提供了科學(xué)依據(jù)。