張會麗，盧光莉，黃文龍，胡國強**

(1鄭州工業(yè)應(yīng)用技術(shù)學(xué)院藥學(xué)院,鄭州 451150；2河南大學(xué)商學(xué)院,開封 475001；3中國藥科大學(xué)新藥研究中心,南京 210009)

氟喹諾酮藥物通過抑制細菌DNA回旋酶(DNA gyrase)和Ⅳ類拓撲異構(gòu)酶(DNA Topoisomerase Ⅳ，Topo Ⅳ)而發(fā)揮抗菌活性，其中，DNA拓撲異構(gòu)酶也是廣泛存在于真核細胞核中的基本酶，二者具有同源和功能相似性，對DNA的轉(zhuǎn)錄、復(fù)制以及基因表達過程中的DNA拓撲結(jié)構(gòu)的改變起著重要的作用[1]。同時，DNA拓撲異構(gòu)酶在腫瘤組織中高度表達與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，抑制拓撲異構(gòu)酶的活性就能阻止腫瘤細胞的快速增殖[2]。因此，基于機制的理性藥物設(shè)計策略，通過氟喹諾酮結(jié)構(gòu)修飾可將其抗菌活性轉(zhuǎn)化為抗腫瘤活性，進而促進抗腫瘤氟喹諾酮先導(dǎo)物的發(fā)現(xiàn)[3]。與此同時，氟喹諾酮的構(gòu)效關(guān)系表明，喹啉-4-酮-3-羧酸這一基團為其抗菌活性藥效骨架，而C-3羧基用唑稠雜環(huán)[4]或酰胺基[5]等生物等排體替代，并引入具有廣泛藥理活性的α，β-不飽和酮[6]片段作為其功能修飾基可顯著提高抗腫瘤活性，提示C-3羧基并非是抗腫瘤活性所必需的藥效團，喹啉-4-酮骨架可能是需保留的抗腫瘤藥效骨架，而α，β-不飽和酮作為C-3等排體的功能修飾基在抗腫瘤活性中所發(fā)揮的重要作用值得進一步探究。為此，選擇α，β-不飽和酮藥效團作為C-3羧基的等排體而非修飾基、用含有理化性質(zhì)各異的N、O、S供電子原子的噻唑酮繞丹寧[7]為其稠合修飾基進而構(gòu)建α，β-不飽和噻唑酮骨架，并與喹啉-4-酮骨架相拼合，設(shè)計合成了氟喹諾酮-3-甲叉基繞丹寧類目標化合物(6a～6l)，并通過體外抗細胞增殖活性篩選結(jié)果評價α，β-不飽和酮作為C-3羧基的生物電子等排體、繞丹寧為其稠合修飾基的可行性，為抗腫瘤氟喹諾酮分子的構(gòu)建提供新途徑。

1 合成路線

目標化合物(6a～6l)的合成見路線1。培氟沙星(1)與水合肼發(fā)生肼解反應(yīng)得到培氟沙星酰肼(2)、在稀氨水介質(zhì)中用鐵氰化鉀氧化脫肼基反應(yīng)得到培氟沙星-3-甲醛(3)。另外，胺類化合物(4a～4l)與雙(羧甲基)三硫代碳酸酯發(fā)生縮合反應(yīng)生成N-取代繞丹寧(5a～5l)，再與氟喹諾酮-3-甲醛(3)進行Claisen-Schmidt縮合反應(yīng)形成氟喹諾酮-3-甲叉基噻唑酮目標化合物(6a～6l)。

Scheme1 Synthetic route of the title compounds6a-6lR:C6H5(a);4-CH3-C6H4(b);4-CH3O-C6H4(c);4-F-C6H4(d);4-Cl-C6H4(e);4-Br-C6H4(f);3-F3C-C6H4(g);H(h);amino(i);c-Pr(j);HO2CCH2(k);benzyl(l)

2 實驗部分

2.1 材 料

WK-1B數(shù)字熔點儀(上海申光儀器有限公司)；AM-400型核磁共振儀(德國Bruker公司)；Esquire LC型質(zhì)譜儀(德國Bruker公司)；PE2400-Ⅱ元素分析儀(美國PE公司)。培氟沙星酰肼2[8]和繞丹寧類5[9]分別按文獻的方法制備，其他試劑均為市售分析純。實驗用腫瘤細胞株購于中科院上海細胞生物研究所；非洲綠猴腎細胞Vero購買于上海通派生物科技有限公司。

2.2 化學(xué)合成

1-乙基-6-氟-7-(4-甲基哌嗪-1-基)-3-喹啉-4-(1H)-酮-3-甲醛(3)的合成

鐵氰化鉀48.0 g(146.0 mmol)溶于蒸餾水150 mL中，加入濃氨水40 mL和氯仿250 mL，常溫攪拌下慢慢加入化合物2(15 g，43.0 mmol)約1 h。常溫攪拌反應(yīng)至原料消失(TLC)，抽濾。分出有機相，用水洗滌3次，無水Na2SO4干燥。過濾，常壓回收氯仿，殘余物用無水乙醇-乙酸乙酯(1∶1)混合溶劑100 mL溶解，加入適量活性炭回流脫色0.5 h。過濾，靜置2 d，析出淡黃色結(jié)晶3，收率41.6%，mp:235～237 ℃(229～233 ℃[10]);1H NMR(400 MHz,CDCl3-d6)δ:10.84(1H,s,3-CHO),8.82(1H,s,2-H),7.84(1H,d,J=13.0 Hz,5-H),7.36(1H,d,J=8.0 Hz,8-H),4.46(2H,q,J=8.0 Hz,CH2),3.46～3.28(4H,m,piperazine-H),2.48～2.66(4H,m,piperazine-H),2.38(3H,s,N-CH3),1.47(3H,t,J=8.0 Hz,CH3);MSm/z:318[M+H]+。

1-乙基-6-氟-7-(4-甲基哌嗪-1-基)-3-(3-取代-繞丹寧-5-叉甲基)-喹啉-4-(1H)-酮(6a～6l)合成通法

氟喹諾酮-3-甲醛(3,1.0 g，3.2 mmol)與新熔融的無水乙酸鈉(0.52 g,6.4 mmol)和繞丹寧5a～5l(3.2 mmol)依次加入到冰醋酸(15 mL)中，混合反應(yīng)物油浴磁力攪拌回流反應(yīng)6 h。減壓蒸除溶劑，殘余物加去離子水50 mL溶解，用適量活性炭脫色。濾液用濃氨水調(diào)pH 8.0，二氯甲烷提取(30 mL×3)，飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥。粗品用無水乙醇-DMF重結(jié)晶，得金黃色粉末目標物6a～6l。

1-乙基-6-氟-7-(4-甲基哌嗪-1-基)-3-(3-苯基-繞丹寧-5-叉甲基)-喹啉-4-(1H)-酮(6a) 收率64.4%，mp:255～257 ℃；1H NMR(400 MHz,CDCl3-d3)δ:7.85(1H,d,J=13.0 Hz,5-H),7.75(1H,s,2-H),7.51～7.26(6H,m,Ph-H and 3-CH==),6.66(1H,d,J=8.0 Hz,8-H),4.20(2H,q,J=8.0 Hz,CH2),3.27(4H,br,piperazine-H),2.65(4H,br,piperazine-H),2.40(3H,s,N-CH3),1.58(3H,t,J=8.0 Hz,CH3);MSm/z:509[M+H]+;Anal.Calcd.for C26H25FN4O2S2:C 61.40%;H 4.95;N 11.01;Found:C 61.63%;H 4.76;N 11.24。

1-乙基-6-氟-7-(4-甲基哌嗪-1-基)-3-[3-(4-甲基苯基)-繞丹寧-5-叉甲基]-喹啉-4-(1H)-酮(6b) 收率57.0%，mp:254～256 ℃；1H NMR(400 MHz,CDCl3-d3)δ:8.68(1H,s,2-H),7.82(1H,d,J=13.0 Hz,5-H),7.54(1H,s,3-CH==),7.34～7.05(5H,m,Ph-H and 8-H),4.40(2H,q,J=8.0 Hz,CH2),3.28(4H,br,piperazine-H),2.50(4H,m,piperazine-H),2.38(3H,s,N-CH3),2.25(3H,s,Ph-CH3),1.42(3H,t,J=8.0 Hz,CH3);MSm/z:523[M+H]+;Anal.Calcd.for C27H27FN4O2S2:C 62.05%;H 5.21;N 10.72;Found:C 62.31%;H 5.38;N 10.95。

1-乙基-6-氟-7-(4-甲基哌嗪-1-基)-3-[3-(4-甲氧基苯基)-繞丹寧-5-叉甲基]-喹啉-4-(1H)-酮(6c) 收率53.0%，mp>260 ℃；1H NMR(400 MHz,CDCl3-d3)δ:7.98～7.77(2H,m,2-H and 5-H),7.54(1H,s,3-CH==),7.27～6.70(5H,m,Ph-H and 8-H),4.22(2H,q,J=8.0 Hz,CH2),3.85(3H,s,OCH3),3.30(4H,m,piperazine-H),2.67(4H,m,piperazine-H),2.41(3H,s,N-CH3),1.59(3H,t,J=8.0 Hz,CH3);MSm/z:539[M+H]+;Anal.Calcd.for C27H27FN4O3S2:C 60.20%;H 5.05;N 10.40;Found:C 60.44%;H 5.18;N 10.67。

1-乙基-6-氟-7-(4-甲基哌嗪-1-基)-3-[3-(4-氟苯基)-繞丹寧-5-叉甲基]-喹啉-4-(1H)-酮(6d) 收率51.0%，mp>260 ℃；1H NMR(400 MHz,CDCl3-d3)δ:8.70(1H,s,2-H),7.81(1H,d,J=13.0 Hz,5-H),7.53(1H,s,3-CH==),7.43～7.05(5H,m,Ph-H and 8-H),4.40(2H,q,J=8.0 Hz,CH2),3.27(4H,br,piperazine-H),2.51(4H,m,piperazine-H),2.26(3H,s,N-CH3),1.42(3H,t,J=8.0 Hz,CH3);MSm/z:527[M+H]+;Anal.Calcd.for C26H24F2N4O2S2:C 59.30%;H 4.59;N 10.64;Found:C 59.55%;H 4.38;N 10.85。

1-乙基-6-氟-7-(4-甲基哌嗪-1-基)-3-[3-(4-氯苯基)-繞丹寧-5-叉甲基]-喹啉-4-(1H)-酮(6e) 收率54.0%，mp>260 ℃；1H NMR(400 MHz,CDCl3-d3)δ:7.94～7.72(2H,m,2-H and 5-H),7.46(1H,s,3-CH==),7.43～6.65(5H,m,Ph-H and 8-H),4.17(2H,q,J=8.0 Hz,CH2),3.27(4H,br,piperazine-H),2.67(4H,m,piperazine-H),2.39(3H,s,N-CH3),1.52(3H,t,J=8.0 Hz,CH3);MSm/z:543[M+H]+(35Cl);Anal.Calcd.for C26H24ClFN4O2S2:C 57.50%;H 4.45;N 10.32;Found:C 57.73%;H 4.32;N 10.57。

1-乙基-6-氟-7-(4-甲基哌嗪-1-基)-3-[3-(4-溴苯基)-繞丹寧-5-叉甲基]-喹啉-4-(1H)-酮(6f) 收率48.0%，mp>260 ℃；1H NMR(400 MHz,CDCl3-d3)δ:8.75(1H,s,2-H),7.80(1H,d,J=13.0 Hz,5-H),7.75(2H,d,J=9.0 Hz,Ph-H),7.56(1H,s,3-CH==),7.37～7.17(3H,m,Ph-H and 8-H),4.44(2H,q,J=8.0 Hz,CH2),3.84～3.52(4H,m,piperazine-H),3.52～3.32(4H,m,piperazine-H),2.36(3H,s,N-CH3),1.43(3H,t,J=8.0 Hz,CH3);MSm/z:587 and 589[M+H]+(79Br and81Br);Anal.Calcd.for C26H24BrFN4O2S2:C 53.15%;H 4.12;N 9.54;Found:C 53.36%;H 3.90;N 9.76。

1-乙基-6-氟-7-(4-甲基哌嗪-1-基)-3-[3-(3-三氟甲基苯基)-繞丹寧-5-叉甲基]-喹啉-4-(1H)-酮(6g) 收率42.0%，mp:252～254 ℃；1H NMR(400 MHz,CDCl3-d3)δ:8.71(1H,s,2-H),7.90～7.74(5H,m,Ph-H and 5-H),7.55(1H,s,3-CH==),7.07(1H,br,8-H),4.39(2H,br,CH2),3.34～3.29(4H,m,piperazine-H),2.62～2.53(4H,m,piperazine-H),2.29(3H,s,N-CH3),1.42(3H,t,J=8.0 Hz,CH3);MSm/z:577[M+H]+;Anal.Calcd.for C27H24F4N4O2S2:C 56.24%;H 4.20;N 9.72;Found:C 56.47%;H 4.38;N 9.95。

1-乙基-6-氟-7-(4-甲基哌嗪-1-基)-3-(繞丹寧-5-叉甲基)-喹啉-4-(1H)-酮(6h) 收率42.0%，mp>260 ℃；1H NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ:8.63(1H,s,2-H),7.85(1H,d,J=13.0Hz,5-H),7.40(1H,s,3-CH==),7.16(1H,d,J=8.0Hz,8-H),4.40(2H,br,CH2),3.34(4H,br,piperazine-H),2.53(4H,br,piperazine-H),2.35(3H,s,N-CH3),1.41(3H,t,J=8.0 Hz,CH3);MSm/z:433[M+H]+;Anal.Calcd.for C20H21FN4O2S2:C 55.54%;H 4.89;N 12.95;Found:C 55.76%;H 4.76;N 13.16。

1-乙基-6-氟-7-(4-甲基哌嗪-1-基)-3-(3-氨基-繞丹寧-5-叉甲基)-喹啉-4-(1H)-酮(6i) 收率54.0%，mp:244～246 ℃；1H NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ:8.68(1H,s,2-H),7.80(1H,d,J=13.0Hz,5-H),7.57(1H,s,3-CH==),7.05(1H,d,J=8.0 Hz,8-H),5.92(2H,s,NH2),4.38(2H,q,J=8.0 Hz,CH2),3.27(4H,br,piperazine-H),2.51(4H,br,piperazine-H),2.25(3H,s,N-CH3),1.42(3H,t,J=8.0 Hz,CH3);MSm/z:448[M+H]+;Anal.Calcd.for C20H22FN5O2S2:C 53.67%;H 4.95;N 15.65;Found:C 53.9276%;H 4.77;N 15.87。

1-乙基-6-氟-7-(4-甲基哌嗪-1-基)-3-(3-環(huán)丙基-繞丹寧-5-叉甲基)-喹啉-4-(1H)-酮(6j) 收率46.0%，mp:252～254 ℃；1H NMR(400 MHz,CDCl3-d3)δ:8.70(1H,s,2-H),7.95(1H,d,J=13.0 Hz,5-H),7.46(1H,s,3-CH==),6.95(1H,d,J=8.0 Hz,8-H),4.22(2H,q,J=8.0 Hz,CH2),3.29(4H,m,piperazine-H),2.88(1H,m,c-Pr-H),2.66(4H,br,piperazine-H),2.40(3H,s,N-CH3),1.57(3H,t,J=8.0 Hz,CH3),1.17～1.06(4H,m,c-Pr-H);MSm/z:473[M+H]+;Anal.Calcd.for C23H25FN4O2S2:C 58.45%;H 5.33;N 11.85;Found:C 58.67;H 5.14;N 12.06。

1-乙基-6-氟-7-(4-甲基哌嗪-1-基)-3-(3-羧甲基-繞丹寧-5-叉甲基)-喹啉-4-(1H)-酮(6k) 收率46.0%，mp>260 ℃；1H NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ:8.66(1H,s,2-H),7.81(1H,d,J=13.0 Hz,5-H),7.52(1H,s,3-CH==),7.05(1H,d,J=8.0 Hz,8-H),4.66(2H,s,CH2),4.38(2H,q,J=8.0 Hz,CH2),3.30(4H,m,piperazine-H),2.66(4H,br,piperazine-H),2.36(3H,s,N-CH3),1.42(3H,t,J=8.0 Hz,CH3);MSm/z:491[M+H]+;Anal.Calcd.for C22H23FN4O2S2:C 53.86%;H 4.73;N 11.42;Found:C 54.08;H 4.56;N 11.65。

1-乙基-6-氟-7-(4-甲基哌嗪-1-基)-3-(3-芐基-繞丹寧-5-叉甲基)-喹啉-4-(1H)-酮(6l) 收率52.0%，mp:225～227 ℃；1H NMR(400 MHz,CDCl3-d3)δ:7.90(1H,d,J=13.0 Hz,5-H),7.61(1H,s,2-H),7.43(1H,s,3-CH==),7.38～6.64(6H,m,Ph-H and 8-H),5.23(2H,s,CH2),4.12(2H,q,J=8.0 Hz,CH2),3.26(4H,br,piperazine-H),2.72(4H,br,piperazine-H),2.37(3H,s,N-CH3),1.48(3H,t,J=8.0 Hz,CH3);MSm/z:523[M+H]+;Anal.Calcd.for C27H27FN4O2S2:C 62.05%;H 5.21;N 10.72;Found:C 62.31;H 5.03;N 10.96。

2.3 體外抗細胞增殖活性

對合成的12個目標化合物6a～6l、對照蒽醌類抗腫瘤藥阿霉素(DOX)及母體培氟沙星(1)用DMSO配成1.0×10-2mol/L濃度的儲備液，用RPMI 1640培養(yǎng)液稀釋至所需濃度(0.1、1.0、5.0、10.0、50.0 nmol/L)即為供試液。取對數(shù)生長期的人非小細胞肺癌細胞(A549)、人肝癌細胞(Hep-3B)、人白血病細胞(HL60)和非洲綠猴腎細胞細胞(Vero)株，分別以每孔6 000個細胞接種于96孔板，培養(yǎng)隔夜后，分別加入上述供試液。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后棄去培養(yǎng)基。每孔加入1 g/L MTT溶液100 μL,繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄上清液。每孔加入二甲基亞砜150 μL,輕輕振蕩30 min,用酶標儀在570 nm波長處測其吸收度。計算各組對實驗細胞的抑制率：抑制率(%)=(1-實驗組吸收度/對照組吸收度)×100。然后以各藥物濃度的負對數(shù)值對各濃度下的抑制率作線性回歸，得濃度-效應(yīng)方程，以此計算出各供試化合物對實驗細胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)。所有實驗在相同條件下重復(fù)進行3次，結(jié)果見表1。

Table 1 Anti-proliferative activity of the title compounds 6a- 6l against the tested cells

Compd.ArIC50/(μmol/L)A549Hep-3BHL60Vero6aC6H510.6±1.225.7±1.828.6±2.057.6±2.46b4-CH3-C6H417.6±1.527.6±1.430.6±2.363.2±1.86c4-CH3O-C6H418.3±1.432.6±2.335.0±2.761.5±2.46d4-F-C6H44.7±0.58.6±1.07.8±1.053.6±2.86e4-Cl-C6H42.6±0.44.2±0.510.4±0.747.6±2.56f4-Br-C6H46.7±0.711.6±1.213.5±1.253.0±2.56g3-CF3-C6H48.2±0.516.8±1.618.4±1.650.8±3.76hH20.5±1.626.8±1.823.8±1.560.5±3.06iNH212.6±0.711.6±0.616.8±1.452.8±2.66jc-Pr16.7±1.532.5±2.421.7±1.557.8±2.46kHO2CCH225.8±2.135.8±3.038.6±2.567.8±4.26lbenzyl22.5±1.631.7±2.635.4±3.064.7±3.2Doxorubicin2.5±0.62.7±0.54.2±0.53.8±0.6Pefloxacin>100>100>10067.2±3.6

3 結(jié)果與討論

由培氟沙星(1)制備化合物3的文獻方法[10]是化合物1經(jīng)硼氫化鈉還原并脫羧得到2,3-二氫氟喹諾酮，再與甲酸乙酯縮合得到氟喹諾酮-3-甲醇，然后用活性二氧化錳氧化得到相應(yīng)的醛3。該方法中與甲酸乙酯縮合反應(yīng)步驟需要絕對無水操作，經(jīng)多次嘗試制備氟喹諾酮-3-甲醇未能成功。同時，試圖通過酰肼2與磺酰氯的磺酰化產(chǎn)物C-3?；酋ｋ峦ㄟ^McFadyen-Stevens反應(yīng)[11]到醛3。但該方法需要在高溫160 ℃下在較短的時間(<5 min)內(nèi)完成，操作難度較大。最后，借鑒甲氧芐啶合成中間體三甲氧基苯甲醛的合成方法[12]，用酰肼2在稀氨水-氯仿介質(zhì)中用鐵氰化鉀氧化脫肼基的方法可得到相應(yīng)的氟喹諾酮-3-甲醛(3)。該方法雖收率中等(約為40%)，但可在室溫水相中進行，條件溫和方便，可規(guī)?；苽?，不失為氟喹諾酮羧酸轉(zhuǎn)為氟喹諾酮醛的簡便方法。繞丹寧衍生物5a～5l可由相應(yīng)的胺類4a～4l與雙(羧甲基)三硫代碳酸酯在水中縮環(huán)合而得[9]。為此，制備得到的氟喹諾酮-3-甲醛(3)與繞丹寧衍生物5a～5l發(fā)生Claisen-Schmidt縮合反應(yīng)到目標化合物6a～6l。

體外抗細胞增殖活性結(jié)果表明，12個目標化合物對3種試驗?zāi)[瘤細胞株的IC50均低于40.0 μmol/L，顯著強于母體培氟沙星(100 mol/L)的活性。同時，構(gòu)效關(guān)系表明，繞丹寧環(huán)3-位含有鹵代苯基化合物(6d、6e、6f)的抗腫瘤活性強于其他取代基，尤其對A549細胞株的IC50均在微摩爾濃度，與對照抗腫瘤藥阿霉素相當(dāng)。更有意義的是，12個目標化合物對正常非洲綠猴腎細胞株Vero的IC50顯著高于對照阿霉素，顯示出一定的選擇性和較低的細胞毒作用，具有成藥性研究的價值。

4 結(jié) 論

氟喹諾酮羧酸可通過其酰肼的鐵氰化鉀氧化反應(yīng)方便制備相應(yīng)的氟喹諾酮醛，然后與繞丹寧衍生物發(fā)生Claisen-Schmidt縮合反應(yīng)構(gòu)建氟喹諾酮-3-甲叉基繞丹寧類目標化合物。體外抗細胞增殖活性實驗表明，所合成的12個目標化合物的抗腫瘤活性顯著強于母體培氟沙星，部分化合物的活性與對照阿霉素相當(dāng)，且對正常細胞顯示出較低的細胞毒作用，體現(xiàn)出一定的選擇性。為此，由繞丹寧環(huán)稠合修飾的α，β-不飽和酮作為C-3羧基的等排體有利于提高氟喹諾酮的抗腫瘤活性。