孫曉峰，劉 濤，凌 蕓，陳正煒，潘梓浩，徐子特，羅 令

(1湖南中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)院組胚教研室，長沙 410208；2湖南中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)院，長沙 410208；3湖南中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，長沙 410208；4中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院骨科，長沙 410013)

在腫瘤藥物治療中，降低毒性的關(guān)鍵是利用惡性腫瘤和正常組織之間的解剖、病理生理學(xué)和微環(huán)境差異來積極地靶向腫瘤。分化簇44(CD44)是透明質(zhì)酸(HA)高親和性的受體，其在腫瘤細胞中過表達，是一種理想的受體[1]。目前已有多種抗腫瘤藥物納米遞送系統(tǒng)上市，如Doxil、Daunoxome、Abraxane、Genexol-PM等。近些年來，納米膠束的應(yīng)用也取得了較多進展，其中Supratek公司開發(fā)的阿霉素納米膠束(SP1049C)于2007年12月被用于上胃腸道轉(zhuǎn)移性腺癌的Ⅲ期臨床試驗。目前，SP1049C已被美國FDA認(rèn)定為治療食管癌的孤兒藥，療效顯著。本文綜述了HA納米膠束用于腫瘤靶向及釋放行為的研究進展。體內(nèi)外(HA)實驗研究表明，基于HA的納米載體是靶向特異性的藥物和基因傳遞平臺，在臨床腫瘤治療中具有良好的應(yīng)用前景。

1 透明質(zhì)酸和CD44受體

HA是一種天然的糖胺聚糖，由Meyer和他的助手John于1934年首次從牛眼玻璃體中提取出來[2]。這種大分子聚合物的相對分子質(zhì)量隨著鏈長度的變化而變化，從幾千到數(shù)百萬道爾頓不等[3]。眾所周知，與受體結(jié)合的HA有助于血管生成、組織形成、細胞信號傳導(dǎo)、傷口愈合和組織水合作用，在細胞外基質(zhì)中扮演著關(guān)鍵角色[4-5]。另外，HA能夠增強其受體高表達細胞的藥物攝取率，從而提高藥效[6]。CD44是HA的主要受體，是一種在許多腫瘤中過度表達的跨膜糖蛋白[7]。CD44受體在基因表達上有可變的外顯子拼接法和轉(zhuǎn)錄后修飾，存在許多亞型[8]，其在N端附近含有一個特定于HA的結(jié)合域，而與HA結(jié)合是CD44受體大多數(shù)功能的起始步驟[9]。

圖1 透明質(zhì)酸(HA)的結(jié)構(gòu)和功能

1.1 HA-CD44在腫瘤進展中的相互作用

HA和CD44表現(xiàn)出一系列信號通路之間的相互作用，這些信號通路決定了腫瘤細胞的黏附、轉(zhuǎn)移和生長情況，能夠引起惡性腫瘤發(fā)展和腫瘤轉(zhuǎn)移。Anttila等[10]通過評估HA水平和CD44的表達，證明了基質(zhì)HA積累與腫瘤進展相關(guān)，但是他們認(rèn)為HA的聚集與人卵巢癌細胞表面的CD44表達無關(guān)。另一個重要方面是CD44天然體和變異體在腫瘤中都有表達，且參與腫瘤的發(fā)生，它們在HA受體結(jié)合中起著關(guān)鍵作用。CD44v6是CD44的一種變異體，能夠激活Wnt/β-catenin通路，并影響結(jié)腸腫瘤干細胞的轉(zhuǎn)移[11]。Zhao等[12]的研究發(fā)現(xiàn)CD44在肺癌細胞中通過激活絲裂原蛋白激酶(MAPK)信號引起細胞增殖，然而刪除CD44的基因編碼會抑制小鼠體內(nèi)Kras介導(dǎo)的肺腺癌增殖。此外，HA-CD44相互作用會促使錨定蛋白(ankyrin)與MDR-1結(jié)合，排出化療藥物，導(dǎo)致腫瘤細胞化療耐藥[13]。在另一項研究中，Chen和Bourguignon[14]指出HA與CD44相互作用能夠促進c-Jun信號傳導(dǎo)和miRNA21表達，導(dǎo)致三陰性乳腺癌細胞中Bcl-2/IAP上調(diào)表達以及出現(xiàn)化學(xué)抗性。

1.2 CD44是腫瘤診斷中的生物標(biāo)志物

在各種腫瘤細胞中，CD44或其亞型可作為診斷腫瘤的生物標(biāo)志物。Wu等[15]報道了在基底乳腺癌中CD44的mRNA和蛋白高表達水平之間的關(guān)系，強調(diào)CD44作為診斷基底乳腺癌的生物標(biāo)志物的有效性。此外，Desai等[16]的一項研究發(fā)現(xiàn)，CD44的變異體CD44v和CD44s在前列腺癌PC3細胞表面高度表達，并在PC3/OPN克隆表達高水平全長度骨蛋白時增加。其中，CD44v9被報道可以作為一種生物標(biāo)志物檢測上尿路上皮癌的復(fù)發(fā)率和死亡率[17]。另外一項大規(guī)模免疫組織化學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，CD44v6在識別卵巢癌遠處轉(zhuǎn)移患者中起著至關(guān)重要的作用[18]。CD44的變體還可以作為早期檢測工具來預(yù)測腫瘤復(fù)發(fā)。有研究表明，在原發(fā)性胃癌組織中，CD44v9能夠檢測曾接受過多次早期胃癌治療患者的復(fù)發(fā)[19]?；谝陨涎芯繄蟮揽梢缘贸?，無論是單個CD44，還是與另一種蛋白相互作用的CD44及其變異體，都在腫瘤診斷中起著重要作用。

2 CD44受體在腫瘤中過表達

HA的藥物納米載體在多種腫瘤中的效果已經(jīng)得到了驗證，研究顯示有巨大成效。下列所述腫瘤都表現(xiàn)出CD44受體的過度表達，基于HA的藥物載體治療是它們的理想選擇。

2.1 乳腺癌

CD44受體在許多乳腺癌亞型中過度表達，其中在三陰性乳腺癌中顯著過表達[20]。Berner等[21]研究報道，在110例乳腺癌患者中，CD44s，CD44v5，CD44v6，CD44v7呈陽性的比例分別為60%、79%、74%和54%。Li等[22]在一個裝滿紫杉醇(Taxol)的HA-脫氧膽酸(DOCA)共聚物中合成了平均直徑為120 nm的靶向膠束，實現(xiàn)了34%的載藥量。利用MTT實驗分析并對比這個配方與臨床上使用的紫杉醇在MDA-MB-231乳腺癌細胞和正常成纖維細胞(HELF)中的細胞毒性，結(jié)果顯示，與紫杉醇相比，紫杉醇負(fù)荷的HA膠束對CD44陽性的腫瘤細胞有較強的細胞毒性；在對HELF細胞進行測試時，該制劑的毒性小于相同濃度的紫杉醇。這些體外數(shù)據(jù)的結(jié)合顯示出一種有前景的配方，其具有更大的潛力來靶向腫瘤和提高正常細胞的安全性，表明積極的腫瘤靶向是一個有利的選擇。盧增紅等[23]發(fā)現(xiàn)乳腺癌患者淋巴管內(nèi)HA Layilin受體高表達可能與腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移有關(guān)。馬鴻云等[24]合成了乳腺癌靶向的載藥HA納米粒HACDDP-DOX，并發(fā)現(xiàn)該納米?？捎行О邢蛉橄侔┘毎种菩∈笠浦残匀橄侔?。

2.2 結(jié)腸直腸癌

CD44的幾種亞型在結(jié)腸直腸癌(CRC)中過度表達。Amirghofran等[25]研究發(fā)現(xiàn)，在健康人體內(nèi)CD44的含量為[(696±259) ng/mL]，而在結(jié)直腸癌病人中，CD44的含量為[(875±204) ng/mL]，顯著高于健康人體的數(shù)值。由于HA膠束已被證明在體外有效，因此結(jié)腸直腸癌治療成為了一個對HA膠束研究有前景的靶組織[26]。Pitarresi等[27]根據(jù)CD44靶向策略，通過結(jié)合聚乳酸(PLA)的HA形成共聚物，根據(jù)分子的兩親性性質(zhì)，在水溶液中自組合聚合成膠束，設(shè)計出的這種新的膠束配方能夠治療結(jié)腸癌。此外，通過連接聚乙二醇(PEG)可形成聚乳酸膠束，產(chǎn)生聚乙二醇膠束，HA-PLA和HA-PLA-PEG膠束均含有抗腫瘤藥物阿霉素；進一步測試表明，與非聚乙二醇化的制劑相比，HA-PLA-PEG膠束顯示藥物的裝載量增加。在處理CD44陽性和CD44陰性的細胞時加入阿霉素負(fù)荷的配方，比較兩種細胞的細胞毒性。HCT-116人結(jié)腸癌細胞由于CD44受體的過度表達而被用作CD44的靶標(biāo)，而正常的人成纖維細胞則被用于比較差異。MTT細胞增殖試驗證明，HA-PLA和HA-PLA-peg膠束制劑均具有靶向細胞毒性，與用載藥膠束治療的正常組織相比，HCT-116結(jié)腸癌細胞的細胞活力顯著降低。Pitarresi等[27]將這一差異歸因于通過HA-CD44相互作用的膠束攝入的增加，并認(rèn)為HA-PLA配方是一種有前途的體外腫瘤治療手段。

2.3 肝癌

CD44在肝癌細胞中過度表達，Amirghofran等[25]研究發(fā)現(xiàn)CD44v5，CD44v7-8和CD44v10在非腫瘤區(qū)的表達非常微弱，然而在107例肝癌患者中，CD44s，CD44v5，CD44v 6，CD44v7-8和CD44v10的陽性病例分別為34%、49%、27%、38%和24%。Son等[28]利用PLGA聚合物設(shè)計了CD44靶向膠束，將羧基末端與六亞甲基二胺結(jié)合，加入HA偶聯(lián)形成PLGA-胺共聚物，隨后形成了多烯紫杉醇負(fù)荷HA膠束外殼，是一種尺寸約為50～200 nm的球形形態(tài)，其靶向HepG2肝癌細胞，實現(xiàn)了50%甚至更高的藥物釋放率，藥載量為5%～11%。此外，MTT細胞活力分析多烯紫杉醇負(fù)荷HA膠束處理后的結(jié)果表明CD44陽性HepG2肝癌細胞活力呈濃度依賴性降低。然而，在相同濃度的配方中預(yù)處理過量自由HA時，細胞表現(xiàn)出更高的增殖。他們用熒光素異硫氰酸酯(FITC)來標(biāo)記膠束，內(nèi)化后觀察到的熒光強度在預(yù)先處理了HepG2細胞的條件下比預(yù)先處理自由HA條件下多出8倍。這些觀察結(jié)果證實HA共軛膠束利用CD44通路進入細胞，體現(xiàn)了這種方法在靶向CD44過度表達的肝腫瘤治療中的應(yīng)用前景。

2.4 胰腺癌

Li等[29]研究發(fā)現(xiàn)CD44在73.1%胰腺瘤組織中呈陽性。Kesharwani等[31]將HA與苯乙烯馬來酸(SMA)相結(jié)合，在水溶液中形成了自組合的HA-SMA膠束。針對平均直徑114 nm的靶向膠束，一種新型藥物3,4-二氟苯磺酰亞胺(CDF)被用于治療CD44陽性的MiaPaCa-2和AsPC-1胰腺癌細胞系。游離的二氟苯磺酰亞胺在MTT實驗中顯示了對胰腺癌細胞的高毒性，這種效力在HA納米膠束配方中通過靶向遞送進一步增加。對比靶向的HA-SMA-CDF膠束與非靶向SMA-CDF膠束發(fā)現(xiàn)，結(jié)合HA后，細胞攝取和離體癌的毒性增加，表明靶向治療CD44過表達的胰腺腫瘤干細胞可能會助力腫瘤抵抗傳統(tǒng)腫瘤治療[30-31]，CD44受體的過表達有助于患者適應(yīng)使用HA結(jié)合的膠束治療。

3 藥物釋放與納米膠束內(nèi)外部環(huán)境差異的關(guān)系

為系統(tǒng)性管理HA膠束，藥物必須封裝在膠束內(nèi)核心。過早的藥物泄漏會導(dǎo)致靶向部位的活動減少以及增加非靶向組織的不良反應(yīng)，而藥物釋放的百分比和釋放率是治療策略整體療效的關(guān)鍵因素。為了探索藥物釋放的最佳條件，許多研究集中于利用納米膠束內(nèi)部和外部環(huán)境之間的差異或者通過外部刺激后處理應(yīng)用來誘導(dǎo)細胞溶膠中的藥物釋放。

3.1 pH敏感性

Wu等[32]在不同的pH條件下觀察到膠束在酸性環(huán)境中會有更強的釋放。鑒于人體的生理pH是7.4，而溶酶體環(huán)境的pH是5.5，他們提出酸性條件下激活藥物釋放有利于藥物傳遞到靶向腫瘤細胞。Stenzel等[33]利用既定的點擊反應(yīng)概念附加硫醇鹽HA(HA-SH)到磷酰膽堿的側(cè)鏈雙鍵設(shè)計了一個pH敏感HA膠束配方。這一共聚物自組裝成具有10%藥載量的阿霉素膠束，在pH 7.4和pH 5.0下對該制劑的藥物釋放進行了研究。48 h后，酸性條件(pH 5.0)下的阿霉素釋放幾乎是在pH 7.4生理緩沖條件下膠束釋放的兩倍。姜偉偉等[34]指出，在pH 5.0條件下紫杉醇的藥物釋放量明顯高于生理環(huán)境(pH 7.4)介質(zhì)中藥物的釋放量，且在72 h后有突釋現(xiàn)象，可以實現(xiàn)在酸性條件下靶向治療腫瘤細胞的效果。由此可以得出，酸性條件更有利于藥物釋放并靶向腫瘤細胞。

3.2 氧化還原敏感性

在腫瘤研究中，膠束藥物遞送策略常見疏水藥物釋放緩慢和對靶位點缺乏特異性這兩個缺點，它們會增加藥物副作用，同時限制抗腫瘤效果。為了克服這些挑戰(zhàn)，Li等[35]合成了HA-ss-XXXX(DOCA)聚合物作為用于抗腫瘤藥物紫杉醇的遞送系統(tǒng)。通過結(jié)合HA，共聚物通過二硫鍵連接，預(yù)期靶向受體CD44的特異性增加，且細胞溶膠中谷胱甘肽(GSH)的減少會導(dǎo)致更快的藥物釋放。研究顯示，HA-ss-DOCA膠束顯著提高了紫杉醇的載藥量，包封率為93.2%，載藥量達到34.1%。在10 mmol/L GSH存在下觀察到HA-ss-DOCA膠束緩慢釋放紫杉醇，前4 h內(nèi)只有6.3%的紫杉醇被釋放；而當(dāng)GSH濃度高達20 mmol/L時，4 h內(nèi)釋放約55.2%的PTX，24 h釋放90%以上。他們證實了二硫鍵在此配方中的重要性，并在最高濃度(20 mmol/L)GSH的情況下，對未連接二硫化物的HA-DOCA膠束進行了合成和測試。在這個測試中，只有6%的紫杉醇在最初的4 h內(nèi)被釋放。MTT細胞增殖試驗的結(jié)果與初步結(jié)果一致，HA-ss-DOCA和HA-DOCA治療72 h后的IC50分別為25.6和56.6 ng/mL。他們使用流式細胞儀發(fā)現(xiàn)與預(yù)處理過量HA的MDA-MB-231細胞相比，在CD44表達MDA-MB-231人乳腺癌細胞中HA靶向細胞攝取增加。因此，基于這些結(jié)果，Li等[35]展望了HA-ss-DOCA膠束在胞質(zhì)減少環(huán)境中，CD44陽性腫瘤和工程藥物釋放的活性靶向的潛在應(yīng)用。同樣地，余麗麗等[36]研究發(fā)現(xiàn)，在聚乙二醇-聚甲基丙烯酸甲酯的結(jié)構(gòu)中引入含有二硫鍵的交聯(lián)結(jié)構(gòu)，可獲得具有氧化還原敏感性的納米膠束，該膠束中的二硫鍵在細胞內(nèi)的高GSH水平下快速斷裂，可實現(xiàn)藥物的細胞內(nèi)控制釋放。

3.3 高強度聚焦超聲

Liang等[37]研究了高強度聚焦超聲(HIFU)在HA-C16膠束制劑中控制藥物釋放的應(yīng)用。HIFU聚焦波能夠通過干擾聚合物膠束外殼中的聚合物鍵來誘導(dǎo)藥物釋放。在沒有使用HIFU治療的情況下，體外釋放藥物是一個穩(wěn)定的過程，在最初的120 h中只有37%的藥物被釋放。應(yīng)用HIFU后，60%的膠囊在治療后的第40小時被釋放。此外，Zheng等[38]觀察到HIFU暴露后細胞攝取增加，HIFU通過細胞膜增加滲透性，表明HIFU在體外誘導(dǎo)藥物攝取和釋放、增強藥物傳遞到腫瘤方面都具有應(yīng)用可能性。他們還比較了無HIFU條件下載藥12 h和載藥36 h的DTX膠束的釋放情況，發(fā)現(xiàn)HIFU觸發(fā)DTX突然釋放后，DTX釋放模式加快。此外，有研究者通過酰胺反應(yīng)在HA上接枝了硝基咪唑，并通過超聲法制備了缺氧響應(yīng)型聚合物膠束，利用DLS，AFM，TEM等手段表征了聚合物膠束缺氧響應(yīng)前后大小及形貌的變化，利用HPLC研究了膠束的藥物釋放特性。結(jié)果表明該聚合物膠束對缺氧具有響應(yīng)性，負(fù)載藥物的膠束粒子在常氧環(huán)境下不會發(fā)生突釋，而在缺氧環(huán)境下藥物可以快速完全地釋放，證明該膠束粒子具有作為抗腫瘤藥物載體的潛力，并為藥物控釋體系的研究提供了新的思路。

3.4 HA酶

有研究指出，乳腺腫瘤細胞內(nèi)部含有高濃度的HA酶(hyaluronidase,HAase)，可以把HA為基礎(chǔ)的藥物載體快速降解，釋放藥物并作用于腫瘤細胞[39-40]。Feng等[41]構(gòu)建了一種腫瘤靶向和多重刺激響應(yīng)的核殼結(jié)構(gòu)納米粒，該納米?？梢酝ㄟ^乳腺癌細胞MCF-7上的CD44受體介導(dǎo)進入細胞，然后在HA酶作用及近紅外光照射和溶酶體弱酸性環(huán)境的刺激下，協(xié)同把藥物釋放出來，結(jié)果顯示實驗小鼠體內(nèi)的腫瘤體積抑制率最高達到88.9%。因此，腫瘤部位高表達的HA酶能夠快速降解HA，從而促進藥物釋放。Csapó等[42]發(fā)現(xiàn)從cl-HyA/50%中釋放KP的動力學(xué)是最快的，但是控制得很差。通過將鏈接器從50%添加到75%和100%進入聚合物，就有可能實現(xiàn)對藥物從聚合物載體釋放更精確的控制。cl-HyA/100%在第7小時結(jié)束時，藥物總含量釋放了近80%。另一方面，使用最少的表面活性劑，在實驗過程中只有60%的活性成分溶解。

4 結(jié) 論

體內(nèi)外研究都有力地證明將HA結(jié)合到膠束的外表面更有利于藥物靶向腫瘤細胞。與被動靶向相結(jié)合，這種主動靶向策略是向CD44過度表達的腫瘤提供化療藥物的一個很有發(fā)展?jié)摿Φ耐緩?。基于HA的納米膠束在生物學(xué)上是安全的，它具有藥物釋放、血液相容性和系統(tǒng)性腫瘤靶向的巨大潛力，在臨床腫瘤治療中具有良好的應(yīng)用前景。