陳 媛，龐楠楠，趙 驍，趙 慧，安夢(mèng)婷，閆 芳，張峰波，丁劍冰△

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830011；2.烏魯木齊市中醫(yī)醫(yī)院檢驗(yàn)科，新疆烏魯木齊 830000)

包蟲(chóng)病主要由兩種絳蟲(chóng)可引發(fā)人包蟲(chóng)?。杭?xì)粒棘球絳蟲(chóng)(Eg)引發(fā)人囊型包蟲(chóng)病(CE)，多房棘球絳蟲(chóng)(Em)引發(fā)人泡型包蟲(chóng)病(AE)[1]。在中國(guó)，以上兩種類型包蟲(chóng)病的患病率在全球?qū)儆谧罡咚剑趪?guó)內(nèi)主要分布于西北五省、西藏、四川等地，新疆是高發(fā)區(qū)之一。

2008 年VELDHOEN等[2]和DARDALHON等[3]同時(shí)報(bào)道了在白細(xì)胞介素(IL)-4和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β同時(shí)存在的情況下可誘導(dǎo)初始CD4+T 細(xì)胞分泌IL-9、IL-10，并將之命名為“Th9”細(xì)胞。Th9細(xì)胞主要分泌IL-9和IL-10細(xì)胞因子，且有其特異的轉(zhuǎn)錄因子富含嘌呤盒1(PU.1)和干擾素調(diào)節(jié)因子-4(IRF-4)[4-6]。作為新型輔助性T細(xì)胞，Th9在大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及在人體內(nèi)作用的研究已成為近年熱點(diǎn)，但Th9細(xì)胞相關(guān)因子在囊型包蟲(chóng)病患者疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的具體機(jī)制尚不清楚。本研究擬通過(guò)檢測(cè)CE患者外周血中IL-9、PU.1、IRF-4和IL-4 mRNA表達(dá)水平，初步探討Th9細(xì)胞相關(guān)因子在細(xì)粒棘球蚴感染后機(jī)體免疫應(yīng)答中所起可能作用。

1 資料與方法

1.1一般資料 采集2015年8月至2017年8月在新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院就醫(yī)和入院的與納入標(biāo)準(zhǔn)相符的CE患者33例作為CE組，且這33例CE患者就診前未接受任何治療，其中男性19 例，女性14 例，年齡19～58 歲，中位年齡30歲；對(duì)這33例CE患者經(jīng)過(guò)外科手術(shù)和阿苯達(dá)唑藥物治療，跟蹤6個(gè)月，通過(guò)影像學(xué)檢查未發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，且沒(méi)有明顯感染癥狀的33例CE患者作為治療后組(PCE組)；30例性別、年齡與患者相匹配新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院的體檢健康的員工作為健康對(duì)照組(HC組)。納入標(biāo)準(zhǔn)：按照包蟲(chóng)病診斷標(biāo)準(zhǔn)并通過(guò)患者病史、影像學(xué)檢查以及體格檢查確診為囊型包蟲(chóng)病的患者，并經(jīng)手術(shù)、病理檢查證實(shí)。排除標(biāo)準(zhǔn)：使用抗炎藥；合并其他疾病的患者，如急慢性病毒感染、自身免疫性疾病、腫瘤、風(fēng)濕性疾病、膿毒血癥、嚴(yán)重上呼吸道感染、高熱、膽囊炎、肺炎、其他寄生蟲(chóng)疾病等。

1.2儀器與試劑 總RNA 提取試劑盒購(gòu)自 Qaigen 公司，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑盒購(gòu)自SYBER GREEN公司，實(shí)時(shí)定量試劑盒購(gòu)自 TaKaRa公司 ；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀；電泳儀及凝膠自動(dòng)成像系統(tǒng)、xMark全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀均購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3方法

1.3.1引物設(shè)計(jì) 按照Gen Bank 中人 β-actin、 IL-9、PU.1、IRF-4和IL-4 mRNA引物序列，以β-actin作為參照基因，全部引物均由大連寶生物工程有限公司合成，引物基本信息詳見(jiàn)表1。

表1 引物序列及擴(kuò)增長(zhǎng)度

1.3.2總RNA的提取和cDNA的合成 于早晨用枸櫞酸鈉抗凝管采集每位研究對(duì)象空腹靜脈血5 mL。外周血總RNA的提取按照Qaigen 公司提供的試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，從每個(gè)外周血標(biāo)本中取 1 μg 總RNA作為模板，然后在依據(jù)SYBER GREEN公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1.3.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR(QRT-PCR)檢測(cè)IL-9、PU.1、IRF-4、IL-4 mRNA表達(dá) 依據(jù)TaKaRa 公司的實(shí)時(shí)定量試劑盒說(shuō)明書在冰上配制PCR 反應(yīng)液，每一個(gè)樣本重復(fù)3 次，待反應(yīng)結(jié)束后得到一條熒光擴(kuò)增曲線及溶解曲線。使用標(biāo)準(zhǔn)品已知起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值作為橫坐標(biāo)，以測(cè)得的循環(huán)閾值(Ct)作為縱坐標(biāo)，做出標(biāo)準(zhǔn)曲線。將β-actin作為參照基因，選用2-ΔΔCt相對(duì)定量法來(lái)確定特定熒光域值對(duì)應(yīng)循環(huán)數(shù)的 Ct 值，對(duì)目標(biāo)基因定量，來(lái)分析對(duì)比各組中IL-9、PU.1、IRF-4、IL-4 mRNA基因表達(dá)差異。

2 結(jié) 果

2.1IL-9 mRNA在HC組、CE組及PCE組外周血中的相對(duì)表達(dá)水平 CE 組IL-9 mRNA的表達(dá)水平(0.098±0.044)明顯高于HC組(0.075±0.038)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),稍高于PCE組(0.078±0.044)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，IL-9 mRNA在PCE組和HC組的表達(dá)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖1。

注：與HC組比較，aP<0.05

圖1 IL-9 mRNA在HC組、CE組及PCE組中相對(duì)表達(dá)量

2.2PU.1 mRNA在HC組、CE組及PCE組外周血中的相對(duì)表達(dá)水平 CE 組 PU.1 mRNA的表達(dá)水平(0.104±0.067)明顯高于HC組(0.052±0.008)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且明顯高于PCE組(0.065±0.035)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),PU.1 mRNA在PCE組和HC組的表達(dá)沒(méi)有明顯差異(P>0.05)。見(jiàn)圖2。

注：與HC組比較，dP<0.01 ；與CE組比較，bP<0.05

圖2 PU.1 mRNA在HC組、CE組及PCE組中相對(duì)表達(dá)量

2.3IRF-4 mRNA在HC組、CE組及PCE組外周血中的相對(duì)表達(dá)水平 IRF-4mRNA在CE組(0.070±0.020)和PCE組(0.067±0.018)的表達(dá)較HC組(0.060±0.013)增高不明顯，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，且IRF-4mRNA在CE、HC組、PCE組的表達(dá)水平?jīng)]有明顯的差異(P>0.05)。見(jiàn)圖3。

圖3 IRF-4mRNA在HC組、CE組及PCE組中相對(duì)表達(dá)量

2.4IL-4 mRNA在HC組、CE組及PCE組外周血中的相對(duì)表達(dá)水平 IL-4是CD4+T細(xì)胞亞群分化為Th9細(xì)胞亞群的重要的上游刺激因子，IL-4mRNA在CE組的表達(dá)水平(1.053±0.317)明顯高于HC組(0.125±0.03)和PCE組(0.53±0.047)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖4。

注：與HC組比較，dP<0.01；與PCE組比較，eP<0.01

圖4 IL-4mRNA在HC組、CE組及CE組中相對(duì)表達(dá)量

注：A為IL-9 mRNA和PU.1 mRNA相對(duì)表達(dá)量之間的相關(guān)性；B為IL-9 mRNA和IRF-4 mRNA相對(duì)表達(dá)量之間的相關(guān)性;C為IL-9 mRNA和IL-4mRNA相對(duì)表達(dá)量之間的相關(guān)性

圖5 IL-9 mRNA和PU.1、IRF-4、IL-4 mRNA相關(guān)性分析

2.5IL-9 mRNA和PU.1、IRF-4、IL-4 mRNA相關(guān)性分析 為了探討 IL-9和PU.1、IRF-4、IL-4 之間的關(guān)系，本研究用Spearman線性相關(guān)性分析法進(jìn)行上述因子的相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，IL-9與轉(zhuǎn)錄因子PU.1、上游誘導(dǎo)因子IL-4mRNA均呈正相關(guān)(PU.1：r=0.974,P<0.000 1；IL-4：r=0.922,P<0.000 1)；IL-9與另一轉(zhuǎn)錄因子IRF-4 mRNA沒(méi)有相關(guān)性(r=0.261，P=0.142)，見(jiàn)圖5。

3 討 論

細(xì)粒棘球蚴在宿主體內(nèi)生長(zhǎng)發(fā)育緩慢，可使機(jī)體出現(xiàn)炎性反應(yīng)和免疫反應(yīng)，感染初期的臨床癥狀并不明顯，感染數(shù)月乃至數(shù)年后才出現(xiàn)突出的臨床癥狀[7]。人感染細(xì)粒棘球蚴后，宿主體內(nèi)會(huì)發(fā)生一系列細(xì)胞免疫和體液免疫的變化，當(dāng)前認(rèn)為這些變化中最重要的是CD4+T 細(xì)胞亞群對(duì)機(jī)體感染免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)過(guò)程。在大多數(shù)感染免疫中，許多研究都認(rèn)為Th1/Th2起著重要的作用。有研究證實(shí)，感染細(xì)粒棘球蚴初期機(jī)體的免疫反應(yīng)以Th1型細(xì)胞免疫為主，Th1細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子有利于機(jī)體清除寄生蟲(chóng)，因此在包蟲(chóng)病感染免疫中對(duì)機(jī)體起到保護(hù)性作用；但在感染中晚期隨著絳蟲(chóng)的寄生和其對(duì)宿主免疫的主動(dòng)調(diào)節(jié)，宿主逐漸向Th2體液免疫反應(yīng)類型轉(zhuǎn)變。由于Th2細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子對(duì)Th1細(xì)胞有抑制作用，可削弱宿主機(jī)體保護(hù)性免疫應(yīng)答，從而使病原體逃避宿主免疫系統(tǒng)的攻擊，有利于寄生蟲(chóng)在宿主體內(nèi)繼續(xù)寄生[8-9]。 之前認(rèn)為Th1/Th2和Th17/Treg 平衡學(xué)說(shuō)是包蟲(chóng)病的免疫學(xué)機(jī)制中的主要部分[10-12]，以前的研究中將IL-9歸于Th2類細(xì)胞，其可作用于多種靶細(xì)胞，參與發(fā)病機(jī)制完全不同的疾病，如過(guò)敏性疾病、自身免疫性疾病、寄生蟲(chóng)感染等[13-15]?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，IL-9是Th9細(xì)胞產(chǎn)生的，作為新型輔助性CD4+效應(yīng)性T細(xì)胞，Th9細(xì)胞在許多疾病中發(fā)揮著重要的作用[4,16-17]，本課題組前期工作研究證實(shí)Th9/IL-9可能參與了細(xì)粒棘球蚴感染的免疫應(yīng)答反應(yīng)過(guò)程[18-20]。但在囊型包蟲(chóng)病中，Th9細(xì)胞因子mRNA水平上的表達(dá)特點(diǎn)研究尚處于空白，本研究顯示IL-9 mRNA在囊型包蟲(chóng)病患者中的表達(dá)明顯高于健康人群，但經(jīng)過(guò)外科手術(shù)和藥物治療成功的患者IL-9 mRNA表達(dá)水平并沒(méi)有顯著減少。其結(jié)果提示在細(xì)粒棘球蚴感染機(jī)體后，寄生蟲(chóng)可能刺激宿主發(fā)生免疫應(yīng)答反應(yīng)并上調(diào)Th9細(xì)胞功能性細(xì)胞因子IL-9 mRNA表達(dá)，PCE組IL-9 mRNA表達(dá)水平變化特點(diǎn)的可能原因是其他IL-9轉(zhuǎn)錄因子開(kāi)始生效或者在轉(zhuǎn)錄水平延遲表達(dá)，但其具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

目前有研究證實(shí)，Th9細(xì)胞主要由兩種途經(jīng)產(chǎn)生：一是初始CD4+T細(xì)胞在體外IL-4和TGF-β聯(lián)合刺激誘導(dǎo)下直接分化而來(lái)；另一個(gè)是在TGF-β單獨(dú)作用下由Th2細(xì)胞轉(zhuǎn)化產(chǎn)生[21]。在研究中，IL-4 mRNA在囊型包蟲(chóng)病患者外周血中的表達(dá)明顯高于健康人群，而且治療成功后其表達(dá)水平明顯減少，與HC組沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。此結(jié)果提示IL-4 作為Th9 細(xì)胞分化的上游因子可能參與CE患者的感染免疫途徑并起到一定的作用并且可能是CE預(yù)后相關(guān)因子，IL-4可能會(huì)削弱Th1細(xì)胞在CE患者體內(nèi)的保護(hù)性免疫機(jī)制并使寄生蟲(chóng)在體內(nèi)繼續(xù)存活。

PU.1、IRF-4是Th9細(xì)胞的特異性轉(zhuǎn)錄因子，其中PU.1作為ETS轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一，可與IL-9 基因的啟動(dòng)子直接結(jié)合，誘導(dǎo)IL-9的表達(dá)，此過(guò)程在其他CD4+T細(xì)胞亞群中未見(jiàn)，僅見(jiàn)于Th9 細(xì)胞。體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，若小鼠PU.1缺乏，其IL-9表達(dá)也極少，如果Th9 細(xì)胞中PU.1 的表達(dá)上調(diào)，相應(yīng)的IL-9表達(dá)也會(huì)增加。在本研究中也發(fā)現(xiàn)CE患者外周血中PU.1 mRNA的表達(dá)明顯增加，同時(shí)在PCE組明顯降低。而另一轉(zhuǎn)錄因子IRF-4 mRNA在CE患者外周血中的表達(dá)增加不明顯，且治療后PCE組變化也不明顯，和HC組比較均沒(méi)有明顯差異。此結(jié)果提示轉(zhuǎn)錄因子PU.1在CE患者感染免疫過(guò)程中對(duì)Th9細(xì)胞分化增殖的調(diào)節(jié)起到一定的作用，而IRF-4可能在過(guò)程中沒(méi)有明顯的作用。

本研究中IL-9和PU.1、IRF-4、IL-4 mRNA相關(guān)性分析結(jié)果顯示，IL-9與轉(zhuǎn)錄因子PU.1、IL-4之間存在明顯的正相關(guān)關(guān)系，與另一轉(zhuǎn)錄因子IRF-4之間沒(méi)有相關(guān)性。因此，隨著Th2細(xì)胞發(fā)揮其在囊型包蟲(chóng)病中晚期主導(dǎo)作用，Th9/IL-9也可能在CE患者感染免疫的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中起一定的作用，PU.1、IL-4 mRNA在治療后下降提示在寄生蟲(chóng)對(duì)機(jī)體的免疫刺激清除后，CE患者體內(nèi)的感染免疫反應(yīng)機(jī)制也可能發(fā)生改變。

4 結(jié) 論

本研究顯示Th9細(xì)胞的相關(guān)因子IL-9、PU.1、IL-4 mRNA 在CE患者外周血中的表達(dá)顯著上調(diào)，在治療后PU.1、IL-4 mRNA表達(dá)水平基本恢復(fù)正常，提示Th9細(xì)胞可能參與了細(xì)粒棘球蚴感染過(guò)程中的免疫應(yīng)答和調(diào)控機(jī)制。但是Th9細(xì)胞在囊型包蟲(chóng)病中的感染免疫的具體機(jī)制有待進(jìn)一步明確。