楊攀，黃麗，唐艷，馮玲，農(nóng)皓如，李玲，曾慶坤

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院廣西水牛研究所南寧530001）

0 引 言

南方水牛乳主產(chǎn)區(qū)氣候相對濕熱，而水牛飼養(yǎng)模式以規(guī)模化與散戶并存，機械擠奶與手工擠奶并存，生乳菌落總數(shù)偏高，加上干酪生產(chǎn)需要將殺菌溫度控制在較低水平。這些因素均不利于產(chǎn)品加工、成熟、貯藏過程中的微生物控制，造成廣西區(qū)內(nèi)企業(yè)生產(chǎn)的干酪極易發(fā)生霉菌、酵母污染。加上成熟干酪需長時間在低溫下進行成熟，生產(chǎn)周期長，增加了微生物控制難度，同時也增加了企業(yè)前期冷藏存貯設(shè)備投入。

霉菌和酵母幾乎在任何食品上都可以生長：谷物、水果、蔬菜、堅果、乳制品等[1]。Filtenborg等認為與各食品霉變相關(guān)的霉菌只有少量幾種，大部分屬于青霉、曲霉和鐮刀霉。不同的青霉菌會在不同食品冷態(tài)儲存中出現(xiàn)，P.roqueforti和P.commune經(jīng)常會導(dǎo)致硬質(zhì)干酪的腐敗[2]。近平滑假絲酵母、黏紅酵母、克魯維酵母漢遜(氏)德巴利酵母菌是酸奶和其他發(fā)酵乳制品中主要的腐敗菌[3]。

微生物分離和純化主要指的是在相應(yīng)技術(shù)條件輔助下，從高度混雜、種類眾多的細菌群中獲取單一菌落的過程。其通過對目標(biāo)菌株適宜培養(yǎng)條件、培養(yǎng)基進行優(yōu)化和選擇來實現(xiàn)分離、純化的目的[4]。

隨著科學(xué)技術(shù)的進步，微生物的分析手段也日趨完善，特別是以DNA為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)技術(shù)取得較大進展，并廣泛應(yīng)用到食品微生物領(lǐng)域，如實時定量熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)[5]、變性梯度凝膠電泳技術(shù)（DGGE）[6-7]、末端限制性片段長度多態(tài)性分析技術(shù)（TRFLP）[8-9]等。近幾年來，高通量測序技術(shù)快速發(fā)展，代表性的測序平臺包括Illumina、Roche、Ion Torrent等[10]，為微生物群落分析提供了新的手段。高通量測序技術(shù)可以檢測到樣本中傳統(tǒng)純培養(yǎng)不能發(fā)現(xiàn)的低豐度細菌種類，從而更加準(zhǔn)確、全面地反映樣本中的微生物群落結(jié)構(gòu)[11]。

本實驗主要是通過傳統(tǒng)培養(yǎng)法和高通量測序法研究腐敗干酪中微生物的種類和分布情況，為篩選抑制干酪腐敗的乳酸菌做基礎(chǔ)，對采用天然的防腐劑延長干酪貨架期具有一定的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

腐敗干酪，孟加拉紅培養(yǎng)基（虎紅瓊脂），馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA），乳酸酚棉藍染色液，DNA提取試劑盒，rTaq DNA Polymerase，BSA，Buffer，dNTPS，AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒，Tris-HCl，PCR儀：ABI GeneAmp?9700型，小型離心機，電泳儀，恒溫水浴鍋，QuantiFluorTM-ST藍色熒光定量系統(tǒng)。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品前處理

隨機抽取霉變干酪，根據(jù)不同的霉變顏色分為2組樣品，每組樣品包含3個樣，分別稱取霉變干酪2 g放入18 mL無菌水中浸泡15 min，隨后不斷研磨震蕩至樣品均勻分散，備用。

選取霉變干酪的表面霉變部分和內(nèi)部未霉變部分，分別命名為MGL1、MGL2、MGL3、YGL1、YGL2、YGL3，將樣品送至上海美吉生物有限公司進行高通量測序。

1.2.2 微生物的分離與純化

在無菌操作臺中，吸取0.5 mL的樣品，置于4.5 mL的無菌水中，以10倍稀釋法對其進行梯度稀釋。依次做6個稀釋度10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6，吸取100 μL稀釋度為 10-3、10-4、10-5、10-6的稀釋液分別均勻的涂布于孟加拉紅培養(yǎng)基和PDA培養(yǎng)基中，同時用無菌水做平行實驗。稍后將平板倒置，在28℃±1℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-5天，觀察并記錄[12]。

根據(jù)菌落形態(tài)進行分類，用接種針挑取形態(tài)學(xué)特征不同的菌落，在孟加拉紅培養(yǎng)基和PDA培養(yǎng)基進行劃線分離，從無明顯雜菌開始，28℃±1℃連續(xù)培養(yǎng)三代，直至得到單個菌落純化菌種。

1.2.3 微生物的鑒定與保存

觀察菌落在固體培養(yǎng)基上的特征，包括菌落生長速度、大小、形態(tài)構(gòu)造、顏色、質(zhì)地、高度、表面特征、背面特征、邊緣特征以及培養(yǎng)基的顏色變化、氣味等。

觀察顯微鏡下菌體的形態(tài)。在干凈的載玻片上加一滴乳酸酚棉藍染色液，用接種針從菌落的邊緣處取帶有孢子的菌絲，放入乳酸酚棉藍染色液中，再小心地把菌絲散開，然后用蓋玻片蓋上，注意不要產(chǎn)氣，先低倍鏡檢，必要時再換高倍鏡觀察。

通過鏡檢確保菌株一致，用接種針挑取單個菌落，保存菌種于PDA斜面上，于4℃冷藏保存。

1.2.4 總DNA提取方法

使用FastDNA?RSPIN Kit for Soil試劑盒抽提基因組DNA，具體步驟按照說明書進行。

1.2.5 PCR擴增18S rDNA基因序列

擴增18S rDNA基因引物為真菌通用引物，如表1所示。

表1 PCR擴增引物

將上述提取的DNA作為擴增模板，采用20 μL反應(yīng)體系進行PCR擴增，條件如表2所示，PCR循環(huán)參數(shù)如表3所示。

1.2.6 樣品復(fù)雜度分析

采用稀釋曲線和菌種豐富度指數(shù)（Chao1）、辛普森指數(shù)（Simpson）、香農(nóng)指數(shù)（Shannon）等系列統(tǒng)計學(xué)分析指數(shù)評估樣本中微生物群落的物種豐富度和多樣性。

表2 PCR擴增體系

表3 PCR循環(huán)參數(shù)

1.2.7 物種注釋與評估

為了得到每個OTU對應(yīng)的物種分類信息，采用RDP classifier貝葉斯算法，對97%相似水平的OTU代表序列進行分類學(xué)分析，并分別在各個分類水平，即：domain（域），kingdom（界），phylum（門），class（綱），order（目），family（科），genus（屬），species（種）統(tǒng)計各樣本的群落組成。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學(xué)鑒定

本實驗通過嚴格的實驗操作，篩選、分離和純化霉變干酪，總共得到3株菌，酵母菌1株，青霉菌屬2株，編號為A7、A8、A9，其中A7為酵母菌屬，A8、A9為青霉菌屬。

2.1.1 菌落形態(tài)描述

在28±1℃連續(xù)培養(yǎng)到3代，得到單個菌落的純化菌種，培養(yǎng)至第4天拍照記錄。如圖1所示。

圖1 孟加拉紅培養(yǎng)基上各菌落圖

根據(jù)各菌落在不同培養(yǎng)基上的生長狀況，進行菌落形態(tài)描述，如表4所示。

2.1.2 菌體微觀形態(tài)

培養(yǎng)至第4天，用接種針挑取少量菌體進行鏡檢，結(jié)果如圖2所示。

微觀形態(tài)描述如表5所示。

表4 菌落形態(tài)特征描述

圖2 各菌落微觀形態(tài)圖

表5 菌體微觀形態(tài)描述

2.2 高通量測序

2.2.1DNA提取與PCR擴增結(jié)果

利用18S rDNA來鑒定真菌種類，提取到的總DNA以及擴增的電泳圖見圖1，根據(jù)PCR電泳圖可知1-5號樣品目的條帶大小正確，濃度合適，可進行后續(xù)實驗，而6號樣品的目的條帶未檢測到，無法進行后續(xù)測序?qū)嶒灐?/p>

圖3 基因組DNA提取與PCR擴增電泳圖

2.2.2 樣品復(fù)雜度分析

2.2.2.1 OTU聚類

經(jīng)過對所有樣品的測序結(jié)果進行分析處理，去掉測序質(zhì)量差的序列后，MGL1-3 3個樣品共得到96046條高質(zhì)量序列，序列平均長度為402.2，YGL1-22個樣品共得到73 643條高質(zhì)量序列，序列平均長度為403.78，每個樣品得到的優(yōu)化序列及序列平均長度見表6。對5個樣品的有效數(shù)據(jù)進行聚類分別得到9個、6個、5個、17個、37個OTU。

表6 各樣品序列統(tǒng)計及OTU聚類表

2.2.2.2 稀釋曲線

稀釋曲線是從樣本中隨機抽取一定數(shù)量的個體，統(tǒng)計這些個體所代表的物種數(shù)目，并以個體數(shù)與物種數(shù)來構(gòu)建曲線。它可以用來比較測序數(shù)據(jù)量不同的樣本中物種的豐富度，也可以用來說明樣本的測序數(shù)據(jù)量是否合理。采用對序列進行隨機抽樣的方法，以抽到的序列數(shù)與它們所能代表OTU的數(shù)目構(gòu)建rarefaction curve，當(dāng)曲線趨向平坦時，說明測序數(shù)據(jù)量合理，更多的數(shù)據(jù)量只會產(chǎn)生少量新的OTU，反之則表明繼續(xù)測序還可能產(chǎn)生較多新的OTU。因此，通過作稀釋性曲線，可得出樣本的測序深度情況。

圖4 樣品在相似水平為97%的稀釋曲線

從圖4可以看出，每個樣品在其測序數(shù)量下均達到了平穩(wěn)期，即增加測序數(shù)量也沒有新的OTU出現(xiàn)，因此，本次測序深度足以檢測到樣品中真菌類群。

2.2.2.3 樣品中真菌類多樣性分析

本實驗采用 97%水平下的 ace、chao、shannon、simpson和微生物的OTU數(shù)量對樣品中真菌多樣性進行分析，具體指標(biāo)見表7所示。

Shannon和Simpson均是用來估算樣本中微生物多樣性指數(shù)之一。Shannon值越大，說明群落多樣性越高，但該值并非單純表示樣品中存在物種的種類多少，還包含樣品中各物種所占比例，即不同物種之間個體分配的均勻性，分布越均勻其多樣性越高。simpson在生態(tài)學(xué)中常用來定量描述一個區(qū)域的生物多樣性，Simpson指數(shù)值越大，說明群落多樣性越低。Simpson多樣性指數(shù)中稀有菌種所起的作用較小，而普遍菌種所起的作用較大。兩個指數(shù)都是反映樣品中菌群豐富度和均勻度的綜合指標(biāo)。

由表5可以看出，樣品的測序覆蓋率在99%以上，樣品YGL-2的Shannon值最大，Simpson指數(shù)最小，OTU最大，說明它的微生物種類比較豐富，群落的多樣性比較高。樣品MGL-3的Shannon值最小，說明它的微生物種類多樣性比較低，物種分布不均勻，結(jié)合圖2可以得知，YGL-2中微生物種類有13種，MGL-3中僅有3種，與多樣性指數(shù)Shannon和Simpson相一致。

表7 不同樣品在97%相似水平下的多樣性指數(shù)

2.2.3 物種注釋

不同分類水平上的物種注釋，結(jié)果見圖2。

由圖5可看出，腐敗干酪外表霉變部分在目上的分類主要是酵母目和散囊菌目，腐敗干酪內(nèi)部的菌種種類豐富，不僅含有酵母目和散囊菌目，而且包含有真菌銀耳目、肉座菌目、鎖擲酵母目，真核生物以及其他種類。腐敗干酪外表霉變部分在科水平上的分類主要是發(fā)菌科、酵母科和耶羅威亞酵母科，腐敗干酪內(nèi)部的菌種，還包含有絲孢酵母科、未分類的肉座菌科、未界定的銀耳科和鎖擲酵母科以及Cystofilobasidiaceae、Mammalia和Choreotrichia。腐敗干酪中霉變部分在屬水平上的分類的主要菌群為青霉（發(fā)菌科，霉菌）、德巴利（氏）酵母屬、耐堿酵母屬和未分類的酵母菌屬，內(nèi)部未霉變干酪的菌群種類更豐富，不僅包含有霉變部分的菌群，還有未分類的真核生物、絲孢酵母屬、木拉克酵母屬、雙足囊菌屬以及Mammalia和Choreotrichia等。

3 結(jié) 論

通過傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)法，經(jīng)過分離、純化得到3株不同的微生物，通過鏡檢和微生物形態(tài)學(xué)分析，得出三株微生物分別屬于酵母菌屬和青霉菌屬。

通過18S rDNA高通量測序法，根據(jù)稀釋曲線、OTU聚類以及樣品的多樣性分析來反映腐敗干酪中微生物的菌群，得出腐敗干酪中微生物菌群主要有青霉菌屬、德巴利（氏）酵母屬、耐堿酵母屬、未分類的酵母菌屬、絲孢酵母菌屬、木拉克酵母屬、雙足囊菌屬以及未分類的真核生物。

3個霉變干酪樣品中50%～80%為青霉菌屬，20%～40%為德巴利（氏）酵母屬，其余為未分類的酵母菌屬。另外3個未霉變部分的微生物菌群比較豐富，包含有絲孢酵母屬、木拉克酵母屬、雙足囊菌屬以及Mammalia和Choreotrichia等13種微生物。

圖5 樣品在目、科、屬水平上的物種注釋

[3]LOUREIRO V,QUEROL A.The prevalence and control of spoilage yeasts in foods and beverages[J].Trends in Food Scienceand Technology,1999,10,356-365.