云中芹 劉淑清 朱正禹 程寶艷

(山東大學(xué)第二醫(yī)院 1招遠分院(玲瓏英誠醫(yī)院)神經(jīng)內(nèi)科，山東 招遠 265400；2神經(jīng)內(nèi)科)

慢性腦缺血為多種因素作用于腦組織，引起腦供血不足、缺血缺氧，腦細胞代謝、功能障礙的一系列病理生理過程〔1,2〕。通過永久性結(jié)扎大鼠雙側(cè)頸總動脈，使其腦組織慢性缺氧、缺血，腦組織正常功能受損，這與血管性癡呆的發(fā)病過程相近。相關(guān)研究顯示〔3〕，腦組織長期缺血可引起大腦皮層神經(jīng)元壞死、梗死灶形成。神經(jīng)細胞的再生受到多種因素的影響，如神經(jīng)影響因子、抑制性蛋白等，而勿動蛋白(Nogo)-A是對神經(jīng)修復(fù)較為不利的一種細胞因子〔4〕。Nogo-A廣泛存在于中樞神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細胞中。本研究探討Nogo-A在慢性前腦缺血致血管性癡呆大鼠中的表達及意義。

1 材料與方法

1.1試劑 多克隆兔抗鼠Nogo-A 抗體(BDBiosciences 公司)；Nogo-A檢測試劑盒，上海江萊生物公司；Morris水迷宮、低溫高速離心機，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所提供。

1.2分組 64只Wistar大鼠，體重280～320 g，由山東大學(xué)動物中心專門購買飼養(yǎng)。在整個實驗過程中，嚴(yán)格遵循山東大學(xué)基礎(chǔ)實驗中心的相關(guān)準(zhǔn)則和管理規(guī)范。

1.3建立血管性癡呆模型 隨機選擇32只大鼠造模，納入癡呆組。大鼠禁食6 h，10%水合氯醛(1.25 ml/100 g)麻醉。頸前部去毛，仰臥手術(shù)臺，頸部正中做1 cm切口，對切口進行鈍性分離，結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈。其余32只大鼠納入對照組，除不結(jié)扎血管外，其余操作相同。操作完成后，縫合皮膚送至飼養(yǎng)房，室溫保持20℃。造模后第5天行Morris水迷宮試驗，每次2 min，每日5次。第3日記錄成績，若逃避潛伏期大于20 s或兩次進入其他盲端則為血管性癡呆模型成功〔5〕。

1.4水迷宮試驗 Morris水迷宮由一個直徑90 cm、高度50 cm的圓柱形水池構(gòu)成，水池的水位為29 cm，水溫(24±1)℃。利用藍色墨水染色，使其顏色呈現(xiàn)出不透明狀態(tài)。在水池之中，設(shè)置一個高度為28cm，直徑為9.5 cm的圓柱形平臺，并確保這個平臺可以移動，并使其頂部沒于水下1 cm處。將水池內(nèi)的空間劃分為4個象限，在第三象限的中央放置此平臺；對其他3個象限進行特殊標(biāo)記，確保整個實驗過程中不發(fā)生位移。首先將大鼠置入水池2 min，熟悉水迷宮環(huán)境。隨機將32只癡呆組大鼠分為4個亞組，每組8只，分別在缺血1 w、2 w、3 w、4 w后分別進行該實驗，檢測跨越平臺次數(shù)、逃避潛伏期及游泳路程〔6〕。對照組在與研究組同步的時間點分別各取8只，測定相關(guān)指標(biāo)。

1.5Nogo-A含量檢測 將各時間點大鼠腹腔注射麻醉，取出腦組織，研磨、離心，取上清液-20℃保存?zhèn)溆?。采用酶?lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測，將3、6、12、24 ng/ml濃度的樣品加入酶標(biāo)板上的標(biāo)準(zhǔn)孔中。將10 μl的待測樣本及40 μl的樣本稀釋液加入到樣本孔之中。每孔加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗體100 μl，封膜、水浴保溫60 min。每孔加滿、甩去洗滌液并拍干，加底物 A、B各50 μl，避光孵育15 min，加終止液50 μl，在450 nm的波長下測量各孔OD值即吸光度值，繪制酶標(biāo)曲線，計算樣本濃度。

1.6統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.2各組水迷宮測試相關(guān)指標(biāo)比較 各組大鼠空間探索實驗軌跡圖見圖1。缺血1、2、3、4 w時，癡呆組跨越平臺次數(shù)顯著低于對照組(P<0.05)，逃避潛伏期、游泳路程顯著高于對照組(P<0.05)，見表1～3。

圖1 各組水迷宮測試空間探索實驗軌跡圖

表1 各組跨越平臺次數(shù)的比較次)

表2 各組逃避潛伏期比較

表3 各組游泳路程比較

2.2各組Nogo-A含量比較 缺血1、2、3、4 w時，癡呆組腦組織Nogo-A含量顯著高于對照組(P<0.05)；且缺血2 w時腦組織Nogo-A含量最高，見表4。

表4 兩組不同時間點腦組織液中Nogo-A含量的比較

3 討 論

關(guān)于慢性腦缺血的發(fā)病機制研究較少〔7〕，研究成果也有限。慢性腦缺血引起的繼發(fā)性血管性癡呆較為常見，其在發(fā)病初期可表現(xiàn)為認知、學(xué)習(xí)能力下降，最后引起持久性認知及神經(jīng)功能損傷。慢性腦缺血的重要病理改變?yōu)槟X白質(zhì)疏松，缺氧引起神經(jīng)纖維稀疏、軸突減少，膠質(zhì)細胞大量增生、血腦屏障破壞。中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后常難以再生，其具體原因尚不完全清楚且較為復(fù)雜，多種神經(jīng)細胞因子及蛋白分子參與其中〔8〕。相關(guān)學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)〔9～11〕，中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后常伴有促神經(jīng)生長因子合成、分泌顯著降低，而生長抑制性神經(jīng)因子顯著增高或過表達，如軸突抑制因子Nogo-A、少突膠質(zhì)細胞白多糖(OMgp)等〔12〕。因此，分析和探討Nogo-A對神經(jīng)再生的影響對于腦缺血致血管性癡呆的研究具有重要意義。

神經(jīng)組織對缺血、缺氧極其敏感，導(dǎo)致能量代謝減低，代謝障礙嚴(yán)重者甚至無法滿足神經(jīng)組織正常需求，從而發(fā)生一定程度的認知、學(xué)習(xí)功能障礙。筆者研究發(fā)現(xiàn)，癡呆組大鼠學(xué)習(xí)、認知能力均損傷；同時，隨著慢性腦缺血時間延長，大鼠學(xué)習(xí)、認知能力還有逐漸下降的趨勢。癡呆組大鼠Nogo-A含量顯著增高，可提示其抑制神經(jīng)纖維再生可能是導(dǎo)致大鼠認知功能減退或障礙的重要因素之一〔13，14〕。相關(guān)學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)〔15〕，哺乳動物神經(jīng)細胞受損后可伴有一定程度的Nogo-A過表達，通過Nogo-A中和抗體促進神經(jīng)軸突細胞生長，恢復(fù)其相應(yīng)的神經(jīng)功能。

因此，慢性腦缺血導(dǎo)致認知功能障礙，且隨缺血時間延長呈進行性發(fā)展，Nogo-A表達升高可能是神經(jīng)細胞功能恢復(fù)緩慢的重要因素之一。