秦鵬飛 談陳界 柴松琦 嚴(yán)嘉寧 趙立峰 韋登明

(寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理教研室,浙江 寧波 315211)

血管性癡呆(VD)是主要由缺血性腦血管疾病導(dǎo)致的認(rèn)知障礙綜合征。單核細(xì)胞趨化蛋白(MCP)-1作為炎性趨化蛋白，在VD的腦組織炎性損傷中起了重要的作用。P38絲裂原活化蛋白激酶級聯(lián)途徑(P38MAPK通路)和腦缺血再灌注損傷密切相關(guān)〔1,2〕，主要參與了炎性應(yīng)激反應(yīng)，但是否參與MCP-1介導(dǎo)的VD腦損傷，少見文獻(xiàn)報(bào)道。小檗堿能夠減弱炎癥遞質(zhì)釋放，抑制炎癥細(xì)胞的分化和趨化，從而產(chǎn)生抗炎作用〔3〕。而小檗堿改善VD患者認(rèn)知功能的機(jī)制是否與小檗堿影響MCP-1和P38MAPK表達(dá)有關(guān)，目前尚未有相關(guān)研究。本實(shí)驗(yàn)通過檢測小檗堿對VD大鼠海馬區(qū)MCP-1和P38MAPK蛋白含量的影響，研究其對VD學(xué)習(xí)記憶的改善效果及相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物及分組 健康清潔級Wistar大鼠60只，體重200～250 g，雄性，由寧波大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，許可證號：SYXK(浙)2013-0191。大鼠自由飲食，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，分為正常組，假手術(shù)組，模型組和小檗堿低、中、高劑量組，每組10只。

1.2試劑儀器 小檗堿(阿拉丁試劑上海有限公司)，水迷宮程序自動控制儀(上海移數(shù)動物學(xué)系統(tǒng))；兔抗大鼠P38MAPK、MCP-1 多克隆抗體，生物素化羊抗兔 IgG、SABC 試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；JD801形態(tài)學(xué)圖像分析系統(tǒng)(江蘇捷達(dá)科技發(fā)展有限公司)，BM-Ⅶ包埋機(jī)(宏業(yè)醫(yī)用儀器公司)；HM-325石蠟切片機(jī)(德國LEICA公司)；CX40生物顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.3模型制備 采用王蕊等〔4〕的方法稍加改進(jìn)后造模。10%水合氯醛按35 mg/kg進(jìn)行腹腔注射麻醉大鼠。大鼠仰臥固定，切開頸部正中皮膚，鈍性分離，暴露右側(cè)頸總動脈(CCA)，隨即分離CCA(同時(shí)分離迷走神經(jīng))，然后穿線。將硝普鈉按3.5 mg/kg的劑量腹腔注射以降低血壓。CCA用動脈夾夾閉30 min，隨即再通1 h，再次夾閉30 min。碘酒消毒后縫合，放回到鼠籠中保溫飼養(yǎng)。假手術(shù)組麻醉及手術(shù)過程同上，但不夾閉CCA。術(shù)后，每只大鼠連續(xù)3 d肌肉注射青霉素16萬U。飼養(yǎng)7 d后，按Longa 5分法標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評判，2分及以上為造模成功大鼠。

1.4給藥方法 小檗堿各劑量組造模前持續(xù)給藥7 d，每日1次，按150 mg/kg(高劑量組)、100 mg/kg(中劑量組)、50 mg/kg(低劑量組)的劑量腹腔注射；模型組和假手術(shù)組、正常組在同樣的時(shí)間點(diǎn)注射1 ml/100 g生理鹽水。造模后小檗堿各劑量組仍予小檗堿治療，共14 d，按150 mg/kg(高劑量組)、100 mg/kg(中劑量組)、50 mg/kg(為低劑量組)腹腔注射，1次/d；模型組、假手術(shù)組和正常組同時(shí)給予腹腔注射1 ml/100 g的生理鹽水。

1.5行為學(xué)檢測 采用Morris水迷宮試驗(yàn)〔5〕，共計(jì)5 d，每天早晨檢測一次，將各組大鼠分別從兩個(gè)入水點(diǎn)面向池壁放入水中，記下大鼠在90 s內(nèi)游上平臺的時(shí)間(逃避潛伏期)，以此來檢測其學(xué)習(xí)能力。

1.6海馬神經(jīng)元凋亡形態(tài)學(xué)觀察 以10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)麻醉大鼠，斷頭取腦，置于冰盤，分離海馬體。常規(guī)脫水、用石蠟包埋，含海馬連續(xù)切片，蘇木精-伊紅(HE)染色。每例取3張切片，盡量使每張切片斷面相似，隨機(jī)選擇10個(gè)海馬CA3區(qū)，高倍鏡(40×10倍)下計(jì)數(shù)神經(jīng)元凋亡數(shù)目，計(jì)算凋亡細(xì)胞所占的百分比〔6〕。

1.7免疫組織化學(xué)方法檢測P38MAPK通路蛋白和MCP-1表達(dá) 石蠟包埋切片后進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。切片經(jīng)常規(guī)脫臘、脫水、3%H2O2滅活內(nèi)源性酶、微波抗原修復(fù)，小心洗滌，使用正常山羊血清封閉，分別滴入一抗P38MAPK(1∶500)和MCP-1(1∶100)，置于濕盒中4℃冰箱環(huán)境過夜。滴加二抗為生物素化羊抗兔IgG，進(jìn)行SABC反應(yīng)和二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色。最后經(jīng)復(fù)染、脫水、透明、封片，于光鏡下進(jìn)行免疫組化染色觀察，胞質(zhì)呈紅褐色為陽性區(qū)域。光鏡(40×10倍)下隨機(jī)選取每張切片的4個(gè)視野，計(jì)算平均積分光密度。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.10軟件行單因素方差分析，兩組間數(shù)據(jù)比較采用SNK檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1小檗堿對各組大鼠行為學(xué)表現(xiàn)的影響 隨著訓(xùn)練天數(shù)的增加，各組均出現(xiàn)逃避潛伏期明顯縮短的情況，相比于正常組，假手術(shù)組的逃避潛伏期差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與假手術(shù)組比較，模型組的逃避潛伏期明顯增加(P<0.05)；而小檗堿各劑量組較模型組的逃避潛伏期明顯縮短(P<0.05)，且隨小檗堿劑量增大，大鼠的逃避潛伏期顯著縮短，存在劑量依賴現(xiàn)象。見表1。

表1 各組水迷宮試驗(yàn)不同時(shí)間點(diǎn)逃避潛伏期

與正常組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05；與高劑量組比較：3)P<0.05；與中劑量組比較：4)P<0.05；下表同

2.2小檗堿對各組大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的影響 正常組和假手術(shù)組大鼠海馬神經(jīng)元正常，未見明顯凋亡，神經(jīng)元凋亡率分別為(2.22±0.72)%、(1.78±0.17)%。模型組大鼠海馬存在大量凋亡細(xì)胞，神經(jīng)元凋亡率為(51.67±8.04)%；經(jīng)小檗堿治療后，各治療組大鼠海馬神經(jīng)元凋亡明顯減少，高、中、低劑量組神經(jīng)元凋亡率分別為(34.11±2.40)%、(40.23±4.45)%、(44.40±4.96)%，與模型組比較差異顯著(P<0.05)。

2.3小檗堿對各組大鼠海馬P38MAPK和MCP-1表達(dá)的影響 在正常組與假手術(shù)組，大鼠的海馬神經(jīng)細(xì)胞僅見少量P38MAPK和MCP-1陽性表達(dá)。模型組比假手術(shù)組P38MAPK和MCP-1表達(dá)明顯增加(P<0.05)。經(jīng)小檗堿治療后，與模型組相比，各劑量組海馬神經(jīng)細(xì)胞P38MAPK和MCP-1的陽性表達(dá)明顯減少(P<0.05)，見表2。

表2 小檗堿對各組海馬P38MAPK和MCP-1表達(dá)的影響積分光密度)

3 討 論

腦缺血引起行為學(xué)障礙是當(dāng)前進(jìn)行VD研究的最常用的經(jīng)典造模方法。本研究采用阻斷動脈的方法制作VD模型，經(jīng)過Morris水迷宮試驗(yàn)證明模型組大鼠學(xué)習(xí)能力明顯減弱，表明本次造模成功〔7〕。MCP-1在VD腦組織的炎性損傷中扮演了重要角色，MCP-1 的大量表達(dá)直接關(guān)系到腦缺血損傷后單核細(xì)胞聚集和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞活化，膠質(zhì)細(xì)胞活化后可產(chǎn)生自由基，通過神經(jīng)毒素的釋放間接造成缺血腦損傷，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞變性和壞死〔8〕。P38MAPK通路與腦缺血再灌注中神經(jīng)細(xì)胞大量損傷有著密切聯(lián)系。VD會導(dǎo)致P38MAPK激活,而抑制P38MAPK的作用能有效保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞免受缺血再灌注損傷。小檗堿也稱黃連素,是一種四氫異喹啉類生物堿,可以減少炎癥介質(zhì)如MCP-1的釋放并抑制其趨化，從而減輕局部炎癥反應(yīng)〔9〕，這對減弱神經(jīng)元壞死凋亡、保護(hù)大腦的認(rèn)知能力起到了至關(guān)重要的作用。魏佑震等〔10，11〕證實(shí)小檗堿對腦缺血后再灌注損傷的海馬CA1區(qū)神經(jīng)元有保護(hù)作用。本研究表明小檗堿對VD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力有改善作用，能保護(hù)VD大鼠大腦的海馬區(qū)神經(jīng)元。免疫組織化學(xué)試驗(yàn)結(jié)果顯示小檗堿治療后MCP-1和P38MAPK表達(dá)明顯降低，因此，筆者認(rèn)為MCP-1和P38MAPK的高表達(dá)參與了VD腦損傷過程，而小檗堿可能通過對MCP-1和P38MAPK表達(dá)的抑制對大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元產(chǎn)生保護(hù)作用，從而增強(qiáng)VD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。