葉群立 張洋洋 羅金健

(鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院 1急診科，河南 鄭州 450000；2消化內(nèi)科)

柚皮素(Nar)是一種廣泛存在于西紅柿、葡萄和枳實(shí)等蕓香科植物中的黃酮類化合物。研究表明，Nar對(duì)乳腺癌、胃癌、肺腺癌等多種腫瘤〔1～6〕的發(fā)生發(fā)展具有很好的抑制作用。ABT-263是一種BH3類似物的Bcl-2抑制劑〔7〕，對(duì)乳腺癌〔8〕、肝癌〔9〕和肺癌〔10〕等具有很好的抗腫瘤作用，然而在胃癌細(xì)胞中的作用未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過Nar和ABT-263的聯(lián)合用藥，探討其對(duì)胃癌細(xì)胞增殖凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1材料與儀器 人胃癌細(xì)胞株SGC7901購于上海慧穎生物科技有限公司；Nar、ABT-263、噻唑藍(lán)(MTT)檢測(cè)試劑盒、胎牛血清和RPMI1640培養(yǎng)基均購于美國Sigma公司；Western印跡所用試劑均購自上海Bio-Rad公司，β-actin(內(nèi)參)單克隆抗體、蛋白激酶B(AKT)及磷酸化(p)-AKT多克隆抗體均購自上海Santa Cruz公司。酶標(biāo)儀和恒溫CO2培養(yǎng)箱分別來自美國Dynex technologies公司和美國Thermo公司，流式細(xì)胞儀和膜聯(lián)蛋白(Annexin)V-FITC/碘化丙啶(PI)試劑盒均購自南京凱基生物公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) 將人胃癌細(xì)胞株SGC7901培養(yǎng)在RPMI-1640培養(yǎng)液(含有10%的胎牛血清，1%的谷氨谷氨酰胺及抗生素)中，細(xì)胞密度調(diào)整為1×104個(gè)/ml，在37℃，5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d，0.25%胰酶消化傳代，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制作用 取經(jīng)胰酶消化處理的上述對(duì)數(shù)期生長的細(xì)胞，制備SGC-7901細(xì)胞懸液，按照1×104個(gè)/孔接種于96孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h后分別加入處理液Nar和ABT-263抑制劑，Nar組濃度分別為 0、30、60、90、120 μmol/L，ABT-263組濃度依次為 0、5、10、15、20 μmol/L，均以0 μmol/L為對(duì)照組；同時(shí)以60 μmol/L Nar+5 μmol/L ABT-263抑制劑為聯(lián)合用藥組，在常規(guī)條件下依次培養(yǎng)24、48、72 h后，加入5 mg/ml MTT溶液，4 h后采用酶標(biāo)儀在450 nm波長下測(cè)其吸光值(A)，根據(jù)公式計(jì)算增殖抑制率(%) =1-A處理組/A對(duì)照組×100%。各濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.4流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 將濃度為5×105個(gè)/ml生長期細(xì)胞接種于6孔板中，共設(shè)4組，分別為對(duì)照組、Nar組、ABT-263組及聯(lián)合用藥組，其中Nar濃度為60 μmol/L，ABT-263的濃度為5 μmol/L。培養(yǎng)24 h，待完全貼壁后，向各處理組中加入藥物處理48 h后，用0.25 %的胰酶消化細(xì)胞，離心，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌，加入5 ml RPMI-1640培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液。取100 μl細(xì)胞懸液各加入5 μl Annexin V-FITC和PI，避光處理10 min，流式細(xì)胞儀法上機(jī)檢測(cè)凋亡率。每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.5Western印跡檢測(cè)AKT相關(guān)蛋白的表達(dá) 收集1.4中藥物處理48 h后的各組細(xì)胞，PBS洗滌后，加入細(xì)胞裂解液，放置15 min，低溫高速離心，吸取上清液，用紫外分光光度計(jì)測(cè)量蛋白濃度。取各組等量的蛋白，加入緩沖液搖勻，進(jìn)行10%十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)。采用半干轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，封閉1 h后將膜與AKT、p-AKT一抗(1:200)置于4℃孵育過夜。加入二抗(1∶1 000)室溫孵育2 h，TBST洗膜，使用Western曝光儀顯影，并用灰度分析軟件Quantity One v4.62進(jìn)行分析蛋白表達(dá)強(qiáng)度。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0軟件進(jìn)行單因素方差分析及LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1Nar和ABT-263對(duì)SGC7901細(xì)胞增殖的抑制作用 隨Nar作用濃度增大及作用時(shí)間延長，對(duì)SGC7901細(xì)胞的增殖抑制率均顯著增加(P<0.05)，見表1。隨ABT-263作用濃度增大及作用時(shí)間延長，對(duì)SGC7901細(xì)胞的增殖抑制率均顯著增加(P<0.05)，見表2。與對(duì)照組比較，Nar組、ABT-263組及聯(lián)合用藥組細(xì)胞的增殖抑制率均顯著增加(P<0.05)；與Nar組和ABT-263組比較，聯(lián)合用藥組細(xì)胞的增殖抑制率均顯著增加(P<0.05)。見表3、圖1。

表1 不同濃度Nar作用下不同培養(yǎng)時(shí)間SGC7901細(xì)胞增殖抑制率的比較

同一時(shí)間與前一濃度比較：1)P<0.05;同一濃度與前一時(shí)間比較：2)P<0.05;表2同

表2 不同濃度ABT-263作用下不同培養(yǎng)時(shí)間SGC7901細(xì)胞增殖抑制率的比較

表3 不同培養(yǎng)時(shí)間各組SGC7901細(xì)胞增殖抑制率比較

與對(duì)照組比較：1)P<0.05;與聯(lián)合用藥組比較：2)P<0.05;表4同

圖1 Nar和APG-1252處理48 h的細(xì)胞凋亡圖

2.2各組細(xì)胞凋亡率比較 Nar組〔(29.58±2.10)%〕和ABT-263組細(xì)胞凋亡率〔(15.82±1.02)%〕均較對(duì)照組顯著升高〔(5.65±0.13)%，P<0.05〕，聯(lián)合用藥組凋亡率〔(58.32±3.45)%〕顯著高于Nar組及ABT-263組(P<0.05)。見圖1。

2.3各組AKT相關(guān)蛋白的表達(dá) 與對(duì)照組比較，Nar組、ABT-263組及聯(lián)合用藥組p-AKT蛋白表達(dá)均顯著降低(P<0.05)；與Nar組和ABT-263組比較，聯(lián)合用藥組p-AKT蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)。各組AKT蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表4、圖2。

表4 各組AKL、p-AKT蛋白表達(dá)比較

1：對(duì)照組；2：Nar組；3：APG-1252組；4：聯(lián)合用藥組圖2 信號(hào)通路AKT相關(guān)蛋白的表達(dá)

3 討 論

胃癌的發(fā)生在早期并不易被察覺也沒有特異性癥狀，一旦發(fā)現(xiàn)就診時(shí)多為晚期。隨著老齡化的加劇，癌癥的防止和治療也越來越迫切〔11，12〕。研究發(fā)現(xiàn)，青年人中胃癌的發(fā)病率逐漸上升〔13〕，Nar是一種油皮苷的苷元，具有廣泛的抗菌、抗癌、抗腫瘤等藥理活性，由于其本身水溶性、脂溶性特點(diǎn)的限制對(duì)其研究還處在臨床應(yīng)用上。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，近年來在胃癌方面的基礎(chǔ)研究也取得了顯著的進(jìn)展，中藥、西藥和抗腫瘤抑制劑間相互聯(lián)合用藥的研究〔14～18〕已成為研究的熱點(diǎn)。

研究發(fā)現(xiàn)，Nar可通過抑制磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/AKT通路中PI3K活性、降低含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-31的活性來促進(jìn)乳腺癌的凋亡〔4〕；阻斷細(xì)胞周期并調(diào)節(jié)AKT及核因子(NF)-κB信號(hào)通路抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖〔19〕；通過下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2和MMP-9表達(dá)抑制胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲〔20〕。ABT-263作為Bcl-2抑制劑的第二代可口服的抗腫瘤藥物，在臨床試驗(yàn)中對(duì)多種癌癥的治療效果非常優(yōu)異〔21〕，與髓細(xì)胞白血病基因(MCL)-1不表達(dá)或微弱表達(dá)關(guān)系密切。

本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示：經(jīng)Nar或ABT-263的不同濃度和不同作用時(shí)間處理的SGC7901細(xì)胞均顯示增殖抑制作用，且呈劑量-時(shí)間依賴性。聯(lián)合用藥后表現(xiàn)出協(xié)同作用。兩藥聯(lián)用后的細(xì)胞凋亡率高于Nar或ABT-263單用。Nar聯(lián)合ABT-263處理48 h的AKT信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)，與Nar、ABT-263單用相比，p-AKT表達(dá)水平進(jìn)一步下降，而AKT表達(dá)受影響不明顯。研究說明，Nar和ABT-263均可通過下調(diào)p-AKT抑制AKT信號(hào)通路，進(jìn)一步達(dá)到抗癌的作用。

綜上，Nar和ABT-263對(duì)胃癌細(xì)胞均有增殖抑制作用和凋亡促進(jìn)作用，同時(shí)兩者聯(lián)用具有一定的協(xié)同增效的作用，且其作用與下調(diào)p-AKT抑制AKT信號(hào)通路有關(guān)。