焦守峰 柴勇 楊鑫民

(1南昌大學第三附屬醫(yī)院，江西 南昌 330000；2江西省兒童醫(yī)院；3南昌大學醫(yī)學部)

年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD) 是一種進展性、退行性疾病，發(fā)病機制尚未完全闡明，尤其是干性AMD仍沒有突破性進展〔1〕。本課題組前期發(fā)現(xiàn)，視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)細胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是AMD病因之一，因此，預防RPE細胞EMT的發(fā)生發(fā)展，可能是治療AMD的新思路。

間充質(zhì)干細胞(MSCs)是一種多能干細胞，存在于各組織中，并可轉(zhuǎn)化為多種組織細胞〔2〕。MSCs是一種重要的免疫調(diào)節(jié)細胞，具有逆轉(zhuǎn)不同背景的肝纖維化作用〔3〕。我們推測在AMD發(fā)病早期，移植MSCs可通過改善EMT機制來改善AMD病變。目前關(guān)于MSCs用于AMD治療的研究較少。本研究擬探討MSCs在實驗性AMD中調(diào)控EMT的作用及機制，以期為臨床運用MSCs治療AMD開拓新思路和提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1主要材料 人RPE細胞素ARPE-19細胞購自美國ATCC公司；達爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM/F-12)購自美國Hyclone公司；胎牛血清購自美國Gibco公司；重組人轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)β1購自美國Peprotech公司；α-平滑肌肌動蛋白(SMA)抗體、閉鎖連接蛋白(ZO)-1抗體、Vimentin抗體、E-cadherin抗體及β-actin抗體均購自美國Abcam公司；辣根過氧化物酶(HRP)標記山羊抗小鼠及山羊抗兔二抗購自武漢博士德公司；CO2細胞培養(yǎng)箱購自日本SANYO公司，實時定量PCR儀與蛋白免疫印跡設備購自美國BIO-RAD公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)與分組 ARPE-19細胞與骨髓MSCs用含10%胎牛血清的DMEM/F-12常規(guī)培養(yǎng)。當細胞生長融合度達約90%時，將細胞分為正常組(CON組)、TGFβ1組及MSCs共培養(yǎng)組(MSCs組)。正常組細胞常規(guī)培養(yǎng)；TGFβ1組加入5 ng/ml的重組人TGFβ1誘導細胞EMT；MSCs組在MSCs與ARPE-19細胞于Transwell共培養(yǎng)的基礎上給予TGFβ1誘導EMT。

1.2.2細胞共培養(yǎng) 培養(yǎng)第3代MSCs與ARPE-19至對數(shù)期，用胰酶消化重懸計數(shù)，按1×106個/孔接種MSCs于Transwell共培養(yǎng)系統(tǒng)下室，將Transwell的上室置于孔中，接種ARPE-19細胞，使上下室的培養(yǎng)液相互通融，從而建立起MSCs與ARPE-19的共培養(yǎng)體系，培養(yǎng)72 h終止培養(yǎng)并分析。

1.2.3CCK8法檢測細胞增殖能力 取對數(shù)期常規(guī)培養(yǎng)及與MSCs共培養(yǎng)的ARPE-19細胞懸液接種于96孔板，每孔總體積100 μl，每孔加入10 μl的CCK8試劑，恒溫箱孵育1.5 h后用酶聯(lián)免疫檢測儀測定450 nm條件下的OD 值。

1.2.4免疫蛋白印跡 提取細胞蛋白質(zhì)進行聚丙烯酰胺凝膠電泳；電泳后蛋白質(zhì)通過電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，用含5%脫脂牛奶的TBST室溫封閉120 min；封閉結(jié)束后4℃下使用一抗孵育過夜，然后用羊抗小鼠IgG或羊抗兔IgG二抗孵育，最后用顯影儀顯示結(jié)果。

1.2.5熒光定量PCR檢測mRNA水平變化 提取各組總RNA，使用紫外分光光度儀測出每個樣品RNA濃度；參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄，收集cDNA進行熒光定量PCR檢測。

1.2.6酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-9和MMP抑制因子(TIMP)-1水平變化 收集各組細胞培養(yǎng)液，根據(jù)MMP-9和TIMP-1檢測試劑盒步驟對其進行檢測，通過檢測450 nm波長條件下的OD值，測定MMP-9和TIMP-1水平。

1.3統(tǒng)計學分析 利用SPSS22.0軟件，計量資料兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1各組ARPE-19細胞增殖能力比較 與CON組〔(99.76±8.53)%〕相比，TGF-β1組ARPE-19細胞的增殖活性顯著降低〔(72.15±12.35)%；P<0.05〕；而MSCs組ARPE-19細胞增殖能力顯著高于TGF-β1組〔(84.63±14.71)%，P<0.05〕。

2.2各組ARPE-19細胞EMT水平變化 通過檢測相關(guān)指標的蛋白水平了解各組細胞EMT發(fā)生情況。結(jié)果顯示，TGFβ1預處理可顯著增加ARPE-19細胞內(nèi)α-SMA與Vimentin的表達，并顯著降低ZO-1和E-cadherin的表達(均P<0.05)，提示TGFβ1誘導ARPE-19細胞發(fā)生顯著EMT；而MSCs共培養(yǎng)能有效降低細胞內(nèi)α-SMA與Vimentin的表達，并顯著升高ZO-1和E-cadherin的表達水平(均P<0.05)，提示MSCs共培養(yǎng)能改善細胞EMT水平。見表1，圖1。

表1 各組EMT指標蛋白水平比較

與CON組比較：1)P<0.05；與TGFβ1組比較：2)P<0.05；下表同

圖1 各組ARPE-19細胞 EMT相關(guān)指標的蛋白水平

2.3各組ARPE-19細胞EMT相關(guān)指標的基因水平比較 各組ARPE-19 細胞EMT相關(guān)指標的基因表達水平變化與蛋白表達水平變化趨勢一致：TGFβ1預處理可顯著增加ARPE-19細胞內(nèi)α-SMA與Vimentin mRNA的表達，并顯著降低ZO-1和E-cadherin mRNA表達(P<0.05)；而MSCs共培養(yǎng)可顯著逆轉(zhuǎn)TGFβ1引起的α-SMA與Vimentin mRNA增高及ZO-1和E-cadherin mRNA水平降低(P<0.05)。見表2。

表2 各組EMT指標mRNA表達水平比較

2.4各組ARPE-19細胞MMP-9和TIMP-1水平比較 ARPE-19細胞經(jīng)TGFβ1刺激后MMP-9、TIMP-1及MMP-9/TIMP-1水平顯著增加，與CON組比較均具有顯著差異(P<0.05)；MSCs組能逆轉(zhuǎn)TGFβ1刺激效應，顯著降低MMP-9、TIMP-1及MMP-9/TIMP-1水平(P<0.05)。見表3。

表3 各組MMP-9、TIMP-1及MMP-9/TIMP-1水平比較

3 討 論

AMD已經(jīng)成為中國老年人群中低視力和致盲的主要原因〔4〕。目前已知，RPE細胞的結(jié)構(gòu)完整對AMD的發(fā)生至關(guān)重要，而EMT的發(fā)生對RPE的完整性有重要影響〔5,6〕。因此，如何抑制RPE細胞EMT的發(fā)展，可能是預防AMD的新思路。

TGFβ1是一類能夠介導EMT發(fā)生的多肽類細胞因子，能夠識別并結(jié)合細胞膜表面的受體，調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄〔7,8〕。本實驗結(jié)果顯示，TGFβ1能引起細胞增殖能力下降；從蛋白及mRNA水平分析EMT水平發(fā)現(xiàn)，TGFβ1刺激能顯著誘導ARPE-19細胞EMT的發(fā)生。同時，TGFβ1刺激ARPE-19細胞后可導致細胞中MMP-9及TIMP-1生成增多，破壞MMP-9/TIMP-1平衡，由此推測TGFβ1可能通過促進細胞外基質(zhì)降解，參與EMT的發(fā)生。

MSCs是一種具有分化能力的多能干細胞，活化后對免疫系統(tǒng)有很強的調(diào)節(jié)作用〔9〕，在角膜燒傷、干燥癥等疾病中的治療效果已被證實。Park等〔10〕向淚腺注射人MSCs后，萎縮的淚腺結(jié)構(gòu)漸趨正常；Acar等〔11〕用MSCs進行滴眼治療眼干燥癥模型也取得理想效果。Kasashima等〔12〕用GFP標記的MSCs注射至鉤針損傷的成年大鼠視網(wǎng)膜下腔，發(fā)現(xiàn)MSCs發(fā)生遷移整合。以上研究都提示MSCs移植對于視網(wǎng)膜損傷等疾病的治療發(fā)揮了積極的作用。本實驗利用MSCs與ARPE-19共培養(yǎng)，能抑制TGFβ1刺激引起的細胞增殖活性降低；且能從蛋白及mRNA水平抑制細胞內(nèi)TGFβ1刺激引起的α-SMA與Vimentin增高，并降低ZO-1和E-cadherin表達水平，提示MSCs共培養(yǎng)能改善細胞EMT水平。此外，MSCs共培養(yǎng)能有效逆轉(zhuǎn)TGFβ1刺激效應，顯著降低MMP-9、TIMP-1及MMP-9/TIMP-1水平，這可能是MSCs共培養(yǎng)抑制EMT發(fā)生的一種機制。