孫靜 龐云瑞 單博穎 薛亞然 牛嗣云 鄭立雙 郗昕

(1河北大學醫(yī)學院組織學胚胎學教研室，河北 保定 071000；2保定市第一醫(yī)院藥學部;3河北大學附屬醫(yī)院中心實驗室)

根據(jù)甲基化芯片篩查結(jié)果〔1〕，從中選出甲基化基因AXL和wnt2b，通過熒光定量聚合酶鏈式反應qRT-PCR、甲基化特異性PCR(MSP)檢測技術，證明了肉蓯蓉能夠調(diào)控睪丸組織AXL和wnt2b基因的表達。本研究擬探討松果菊苷對大鼠睪丸間質(zhì)(Leydig)細胞衰老模型AXL和wnt2b基因的影響。

1 材料和方法

1.1睪丸間質(zhì)(Leydig)細胞的原代培養(yǎng)和純度鑒定 取用2周齡Wistar雄性大鼠幼崽，無菌取出雙側(cè)睪丸組織，浸泡于預冷的PBS中。剝離睪丸組織中白膜，分離得到新鮮、結(jié)構(gòu)完整的睪丸組織。無菌膠原酶Ⅰ消化后，差異貼壁法分離、培養(yǎng)Leydig細胞。

1.2Leydig細胞衰老模型建立與鑒定 依據(jù)“自由基氧化損傷”理論〔2〕建立間質(zhì)細胞衰老模型，將新鮮配制的過氧化氫(H2O2)和FeSO4加入已培養(yǎng)2 d的細胞中，使?jié)舛确謩e為50 μmol/L和100 μmol/L，作用時間分別為8 h(即各加入的體積為2 μl)，成功建立了細胞衰老模型，并用 β-半乳糖苷酶染色成功鑒定細胞衰老狀態(tài)〔3〕。

1.3噻唑鹽(MTT)比色法篩選松果菊苷作用最適濃度 在培養(yǎng)2 d的細胞中加入不同濃度的松果菊苷進行藥物處理，濃度梯度設置為10、20、40、80、160和320 μmol/L，持續(xù)作用1、2、3 d，上機檢測后計算細胞增殖活力，選擇最佳作用于Leydig細胞的濃度。

1.4細胞分組 正常組(培養(yǎng)128 h)，衰老組(氧化損傷8 h，繼續(xù)培養(yǎng)72 h)和松果菊苷組(氧化損傷8 h，松果菊苷用藥繼續(xù)培養(yǎng)72 h)。

1.5qRT-PCR TRIzol法提取Leydig 細胞總RNA，以焦碳酸二乙酯(DEPC)水為對照孔，每孔加入2 μl，設置復孔，用酶標儀進行核酸定量RNA濃度，然后反轉(zhuǎn)錄成cDNA。三組Leydig細胞的內(nèi)參均選擇β-actin ，熒光染料(SYBR)進行實時定量檢測。借助統(tǒng)計軟件SPSS19.0，采用 2-△△ct計算方法統(tǒng)計分析三組的Ct值。引物序列：內(nèi)參β-actin上游引物:CCCATCTATGAGGGTTACGC，下游引物:TTTAATGTCACGCACGATTTC；AXLF上游引物:GGTGGCTGTGAAGACGATG，下游引物:CTCAGATACTCCATGCCACT；wnt2b上游引物:GCTGGACCAAACCTGAACG，下游引物:CAAGAAGTATCGGGAAGCA。

1.6MSP 根據(jù)細胞基因組DNA快速提取試劑盒，提取各組Leydig細胞DNA，核酸定量DNA濃度，一步法完成DNA樣本變性和亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化，擴增甲基化基因AXL和wnt2b。3 % 瓊脂糖凝膠電泳，借助ChampGel 5000系統(tǒng)自帶Lane1軟件，統(tǒng)計分析三組甲基化百分比。引物序列：wnt2b甲基化上游引物：GGGAAAGTAGTTTAGTTGTTTTTG，甲基化下游引物:AAACTCCTTTAACCACACTACCCTC；wnt2b未甲基化上游引物:CGAGGTGGCAAACATCCTATATTAAG，未甲基化下游引物:CTTTGAAGGCTCCACTCCTGCACACT；AXL甲基化上游引物:AAGTATAAGAGTTTTAACTTAAGGTGGG，甲基化下游引物:ACTTACGCTACACCGTACAAAAA；AXL未甲基化上游引物:GGTGGCTGTGAGTTAGTTGAGACGATG，未甲基化下游引物:CCAAACTCAGATACTCCATGTTCTTCC。

1.7統(tǒng)計分析 應用SPSS19.0軟件行方差分析、LSD-t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1MTT 篩選松果菊苷作用濃度結(jié)果 當松果菊苷濃度達到 80 μmol/L，無論作用24 h 或 48 h，細胞活力開始下降，320 μmol/L時下降最明顯；松果菊苷作用 72 h 后，不同濃度間細胞活力無差異，其中相同作用濃度，隨著作用時間延長，72 h時細胞活力最好(P<0.05)。綜合而言，72 h時細胞作用濃度為 20 μmol/L時，細胞增殖活力最佳。見表1。

表1 Leydig 細胞的增殖活力

與320 μmol/L比較，1)P<0.05，與160 μmol/L比較：2)P<0.05；與80 μmol/L比較：3)P<0.05

2.2松果菊苷對衰老Leydig細胞AXL基因的影響 衰老組Leydig細胞 AXL mRNA 的表達水平顯著高于正常組，但甲基化水平明顯低于正常組(P<0.05)。松果菊苷用藥后AXL mRNA 表達水平明顯低于衰老組(P<0.05)，但AXL 的甲基化水平與衰老組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2，圖1。

2.3松果菊苷對衰老Leydig細胞wnt2b基因的影響 衰老組Leydig細胞 wnt2b mRNA 表達水平明顯高于正常組(P<0.05)，甲基化水平顯著低于正常組(P<0.05)。松果菊苷組用藥后wnt2b甲基化水平明顯升高(P<0.05)，但與衰老組Leydig細胞相比，二者wnt2b mRNA 表達水平無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3，圖2。

表2 三組 AXL mRNA 的表達量

與衰老組比較：1)P<0.05，下表同

NG：正常組 AG：衰老組 SGJG：松果菊苷組 nc：陰性對照 M：甲基化 U：未甲基化，圖2同圖1 不同組AXL基因DNA甲基化水平變化

組別mRNA表達水平甲基化百分比(%)正常組0.081±0.0611)0.533±0.0241)衰老組1.000±0.0220.432±0.020松果菊苷組0.870±0.0780.494±0.0101)F值20.45131.449P值0.0000.000

圖2 不同組wnt2b基因DNA甲基化水平變化

3 討 論

H2O2是一種性質(zhì)穩(wěn)定易于獲得的強活性氧，常用于短期內(nèi)氧化損傷誘導的細胞衰老〔2,3〕。de Silva等〔4〕用HaCaT 細胞系研究發(fā)現(xiàn)，HaCaT錨定阻滯會引起氧化應激反應，導致DNA損傷，從而引起了全基因組低甲基化趨勢，表明氧化應激改變DNA甲基化從而導致基因組不穩(wěn)定。Wang等〔5〕研究發(fā)現(xiàn)，SD大鼠通過飲用水口服Cr(vi)不僅會引起血漿氧化應激，而且會導致雄性大鼠血細胞的總體DNA低甲基化，并且在丙二醛(MDA)水平升高和總體DNA甲基化降低之間存在良好的相關性。目前，細胞衰老后的一些生物學特征，如形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變，衰老有關的β-半乳糖苷酶表達，細胞周期停滯在G1期等已經(jīng)得到較好的闡述〔6〕。然而氧化損傷誘導細胞進入永久停滯狀態(tài)的內(nèi)在甲基化機制尚不清楚。因此，更好地理解老化過程中氧化應激和表觀遺傳相互作用，是確定老化過程關鍵基因改變的重要研究機制之一，對確定有效治療衰老的藥物，在衰老期間改善人類健康及衰老和老年病的研究意義重大。

表觀遺傳學逐漸吸引了越來越多的興趣，因為它已經(jīng)證明了在不修飾基因序列的情況下調(diào)節(jié)基因表達的能力，可以積極地影響炎癥和癌癥疾病以及神經(jīng)退行性疾病的預防和發(fā)展過程〔7〕。老化時總的基因組DNA隨機發(fā)生低甲基化。轉(zhuǎn)座因子的DNA序列正常狀態(tài)時沉默，DNA甲基化喪失時則可被激活。在不同的年齡段，一些甲基化的改變可以定向發(fā)生于基因組的特定區(qū)域〔8〕。老化過程中DNA甲基化的部分改變并非是隨機發(fā)生的，大多與重復的DNA序列的CpG低甲基化有關〔8,10〕。Leydig細胞可能隨著細胞的衰老，逐漸喪失睪酮合成能力〔11〕。進而推測Leydig 細胞的衰老狀態(tài)，可能對男性的生殖功能有影響。

AXL 是受體酪氨酸激酶家族 TAM 受體中(Tyro3，AXL 和 MER)成員之一〔3〕。睪酮替代療法(TRT)部分地通過增強Gas6表達來減輕細胞凋亡。此外，AXL的缺失使睪酮失效，這表明AXL是睪酮的重要下游調(diào)節(jié)劑。TRT將通過Gas6/ AXL信號通路改善與衰老相關的組織重塑，暗示其治療老化相關疾病的治療潛力〔12〕。本研究說明松果菊苷可以通過抑制衰老的 Leydig 細胞中 AXL mRNA 表達水平，緩解 Leydig 細胞的衰老狀態(tài)。

wnt蛋白是一個分泌蛋白家族，調(diào)節(jié)基因表達、細胞增殖和細胞分化的許多方面〔13〕。wnt/β-catenin信號通路控制著發(fā)育和成人生活中的各種生物學現(xiàn)象〔14〕。睪丸中wnt/β-連環(huán)蛋白信號特異性促進SSC和祖細胞的增殖〔15〕。也有研究表示wnt2b在附睪頭部高度表達，但在尾部幾乎不存在〔16〕。wnt信號傳導對于小鼠胚胎干細胞等多能性基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)至關重要。盡管如此，wnt信號傳導與表觀遺傳調(diào)控機制之間的聯(lián)系至今尚未闡明。有研究表明wnt信號作為參與表觀遺傳變化的關鍵參與者的新作用，該信號傳導途徑可以保護沉默基因組區(qū)域，并能維持基因組的穩(wěn)定性〔17〕。研究發(fā)現(xiàn)，wnt信號傳導參與睪丸減數(shù)分裂前未分化精原細胞的擴增〔18〕。wnt2b的過表達即可導致組織畸形生長，這主要是通過抑制細胞的周期和分化實現(xiàn)的〔19〕。本研究發(fā)現(xiàn)了松果菊苷可以通過提高wnt2b甲基化水平，改變Leydig細胞的衰老狀態(tài)。