王蕓 陶一鳴 孫國杰 肖佳歡 杜艷軍，2

(1湖北中醫(yī)藥大學(xué)針灸骨傷學(xué)院，湖北 武漢 430061；2湖北省針灸治未病協(xié)同創(chuàng)新中心)

阿爾茨海默病(AD)屬于一種原發(fā)性大腦退行性疾病，隱匿性是其起病特點，以進行性認(rèn)知功能障礙和行為學(xué)改變?yōu)橹饕R床表現(xiàn)。本病的發(fā)病機制十分復(fù)雜，淀粉樣蛋白假說、tau蛋白假說、炎癥和免疫假說、膽堿能功能低下假說、基因突變假說、氧化應(yīng)激和興奮性毒性假說等都是目前較為被接受的學(xué)說〔1〕。AD病位在腦，腎虛髓減、神機失用是AD發(fā)生的根本病機，結(jié)合AD發(fā)病年齡特點，腎虛尤被重視。本研究基于前期研究〔2，3〕，旨在探討益腎調(diào)督法電針對β-淀粉樣蛋白(Aβ)1～42誘導(dǎo)的AD模型大鼠血清、不同腦區(qū)內(nèi)的不同經(jīng)典炎性因子的影響。

1 材料與方法

1.1實驗材料與試劑 Morris水迷宮(成都泰盟科技有限公司)；大鼠腦立體定位儀；牙科鉆；微量注射器；華佗牌Φ0.30×25.00 mm不銹鋼毫針；G6805-Ⅱ型電針治療儀；高速冷凍離心機；顯微鏡(Olympus，Japan)；酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(欣博盛生物科技有限公司)；腫瘤壞死因子(TNF)-α一抗(ab6671)、干擾素(IFN)-γ一抗(ab133566)、白細胞介素(IL)-1β一抗(sc7884)、IL-4一抗(sc53084)、IL-10一抗(ab9969)、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1一抗(ab66043)；10%水合氯醛、4%多聚甲醛等。

1.2實驗方法

1.2.1實驗動物及分組 40只SPF級雄性Wistar大鼠(購自湖北省實驗動物研究中心)，8月齡，體重(380±20)g。適應(yīng)性喂養(yǎng)在溫度(22±2)℃的動物室，自然光線，自由飲水，普通飼料(非鋁制品的器皿中存放)。隨機分為對照組、假手術(shù)組、模型組和治療組各10只。

1.2.2動物模型的復(fù)制 10%的水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射麻醉，于腦立體定位儀上呈俯臥固定，保持前后囟同一水平。剪開頭皮暴露前囟，按照大鼠腦立體定位圖譜〔4〕定位海馬區(qū)域(前囟后3.3 mm，中線左右各旁開1.5 mm，深度3 mm)，微量注射器緩慢注入5 μl聚集肽的 Aβ1～42(制備法：0.1 mg Aβ1～42單體，二甲基亞砜50 μl溶解，離心，加入50 μl 0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖液，稀釋配制成1 μg/μl的溶液，37℃水浴箱孵育7 d)，5 min內(nèi)注射完，靜置3 min，緩慢出針(速度1.0 mm/min)，防止藥物溢出，牙托粉封固，縫合皮膚，造模完成。肌注青霉素G 10萬U，連續(xù)3 d。

1.2.3干預(yù)方法 治療組于模型復(fù)制成功后，參考《實驗針灸學(xué)》動物穴位圖譜選取百會(GV20，頂骨正中)和腎俞(BL23，第2腰椎下兩旁)穴〔5〕，采用0.30 mm×25.00 mm不銹鋼針灸針，百會向前平刺3～5 mm，腎俞穴稍向內(nèi)斜刺5 mm，接 G6805-Ⅱ型治療儀(雙側(cè)腎俞穴交替選擇)，連續(xù)波，頻率5 Hz，強度以后爪輕微抖動為度。1次/d，20 min/次，每療程連續(xù)6 d，療程間間隔1 d，共2個療程。對照組與模型組不予電針刺激。假手術(shù)組僅在造模過程中注射等量生理鹽水，余步驟同模型組。

1.2.4動物取材 經(jīng)10%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射麻醉，仰臥固定，行胸腹聯(lián)合切口，先暴露腹主動脈，采血針管取血，離心取上清液。再切斷肋骨、膈肌，心臟暴露時從左心室插入灌注針頭，并快速灌入無菌生理鹽水，同時剪開右心耳，沖洗血液至肝臟發(fā)白。繼改用4%多聚甲醛灌注固定至軀干四肢僵硬狀。斷頭取腦，視交叉平面后4 mm冠狀切腦，置于4%多聚甲醛外固定24 h。

1.2.5檢測方法 ELISA嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。加入100 μl稀釋的樣品于已包被之反應(yīng)孔中；溫育1～2 h；洗滌后，將稀釋好的100 μl生物素化抗體工作液加入各孔中；溫育1 h；洗滌；已稀釋的100 μl酶結(jié)合物工作液加入各孔中；溫育30 min；將100 μl四甲基聯(lián)苯胺(TMB)底物溶液加入各孔中顯色，37℃，避光反應(yīng)10～30 min；將100 μl 2 mol/L硫酸加入反應(yīng)孔中終止反應(yīng)，顏色由藍變黃的10 min之內(nèi)，450 nm酶標(biāo)下調(diào)零空白對照孔，繼測各孔OD值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和OD值做出標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算出樣本的濃度。免疫組化法，常規(guī)石蠟切片脫蠟至水；乙二胺四乙酸(EDTA)緩沖液抗原修復(fù)；37℃，用3%H2O2孵育25 min，置磷酸鹽緩沖液(PBS)中搖床洗滌3次，5 min/次；吸干，適當(dāng)?shù)稳?%牛血清蛋白(BSA)均勻覆蓋組織，封閉30 min；一抗4℃孵育過夜，后置PBS中搖床洗滌3次，5 min/次；吸干，加入二抗，孵育50 min，再置于PBS中搖床洗滌3次，5 min/次；二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，自來水沖洗終止反應(yīng)；蘇木精復(fù)染、脫水、透明、封片。用顯微鏡采集圖像，每組隨機選取10張400倍視野下圖片，圖片應(yīng)讓組織填滿整個視野。應(yīng)用 Image-Pro Plus6.0軟件分析，記錄每張圖片陽性累積光密度值(IOD值)和面積(Area)，用 IOD/Area求得平均光密度值(MOD)。數(shù)值越大表示含量越多，指標(biāo)陽性表達越強，數(shù)值越小表示陽性表達越弱。

1.3統(tǒng)計分析 采用SPSS22.0軟件進行單因素方差分析、LSD-t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1電針對各組血清不同炎性因子的影響 模型組血清TNF-α、IFN-γ和IL-1β水平明顯高于假手術(shù)組和對照組(均P<0.01)，IL-4、IL-10、TGF-β1水平明顯低于假手術(shù)組和對照組(均P<0.01)。與模型組比較，治療組血清TNF-α、IFN-γ、IL-1β水平顯著下調(diào)，IL-4、IL-10、TGF-β1水平顯著上調(diào)(均P<0.01)，提示電針百會、腎俞穴能夠下調(diào)AD大鼠血清促炎因子TNF-α、IFN-γ和IL-1β的濃度，并上調(diào)AD大鼠血清抗炎因子IL-4、IL-10、TGF-β1的濃度，對血清炎性反應(yīng)的持續(xù)性發(fā)生具有抑制作用。見表1。

2.2電針對各組腦內(nèi)不同炎性因子的影響 模型組海馬區(qū)TNF-α、IFN-γ和 IL-1β的 MOD值均明顯高于對照組和假手術(shù)組(P<0.05，P<0.01)，IL-4、IL-10和 TGF-β1的MOD值明顯低于對照組和假手術(shù)組(P<0.05，P<0.01)。與模型組比較，治療組下調(diào)海馬區(qū)TNF-α、 IFN-γ和IL-1β和上調(diào)海馬區(qū)IL-4、IL-10和TGF-β1的MOD值(P<0.05，P<0.01)。見表2。

表1 各組血清促炎因子TNF-α、IFN-γ、IL-1β和抗炎因子IL-4、IL-10、TGF-β1水平的比較

與對照組和假手術(shù)組比較:1)P<0.01；與模型組比較:2)P<0.01

表2 各組海馬區(qū)促炎因子TNF-α、IFN-γ、IL-1β和抗炎因子IL-4、IL-10、TGF-β1的MOD值比較

與對照組和假手術(shù)組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與模型組比較：3)P<0.05，4)P<0.01

2.3各組腦內(nèi)不同部位免疫組化染色情況 由圖1可見，對照組大鼠皮質(zhì)、海馬區(qū)的神經(jīng)細胞大小均一、齒狀回區(qū)細胞排列致密，未見TNF-α深染；假手術(shù)組在皮質(zhì)區(qū)可見少量棕褐色陽性表達，其他部位TNF-α陽性表達尚不明顯；模型組皮質(zhì)、海馬、齒狀回均可見大量棕褐色陽性表達，海馬區(qū)神經(jīng)細胞層次較紊亂，有細胞核固縮，且附近膠質(zhì)細胞有輕度增生現(xiàn)象；而治療組皮質(zhì)、海馬和齒狀回細胞TNF-α抗體染色則明顯減弱。由圖2可見，在對照組與假手術(shù)組的海馬齒狀回，可見到呈棕褐色的陽性表達。由圖可見，IFN-γ主要表達于海馬部神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞的胞質(zhì)。模型組同對照組比較，陽性胞質(zhì)數(shù)量上較多，染色偏濃；治療組同模型組比較，陽性表達胞質(zhì)較少，且染色偏淡。由圖3可見，對照組、假手術(shù)組大鼠皮質(zhì)、海馬、齒狀回神經(jīng)細胞大小均一、排列較整齊；AD大鼠皮質(zhì)及海馬區(qū)神經(jīng)細胞明顯棕色陽性表達，細胞排列較紊亂；IL-1β棕褐色陽性表達在治療組皮質(zhì)、海馬區(qū)明顯減弱。由圖4可見，對照組皮質(zhì)、海馬區(qū)神經(jīng)細胞形態(tài)清晰，層次緊密，大量神經(jīng)細胞呈棕褐色深染；模型組皮質(zhì)及海馬神經(jīng)細胞IL-4棕褐色陽性表達明顯減少；治療組皮質(zhì)神經(jīng)細胞染色明顯增強。由圖5可見，在對照組與假手術(shù)組大鼠海馬齒狀回，神經(jīng)細胞胞核和胞質(zhì)均可見到呈棕褐色的陽性表達，且細胞核的密度較高，數(shù)目較多，輪廓較清晰。模型組同對照組比較，細胞排列稀疏，IL-10染色偏淡；治療組同模型組比較，陽性表達細胞增多，且IL-10染色偏濃。由圖6可見，對照組皮質(zhì)、海馬、齒狀回大量神經(jīng)細胞呈棕褐色深染；假手術(shù)組皮質(zhì)、海馬、齒狀回神經(jīng)細胞棕褐色陽性表達雖不如對照組明顯，但仍可見到均勻分布的棕褐色細胞；模型組各區(qū)TGF-β1陽性表達明顯減少；治療組較模型組神經(jīng)細胞染色顯著加深，數(shù)量增多。

A：對照組；B：假手術(shù)組；C：模型組；D：治療組；下圖同圖1 各組腦組織TNF-α免疫組化法染色(×400)

圖2 各組腦組織IFN-γ免疫組化法染色(×400)

圖3 各組腦組織IL-1β免疫組化法染色(×400)

圖4 各組腦組織IL-4免疫組化法染色(×400)

圖5 各組腦組織IL-10免疫組化法染色(×400)

圖6 各組腦組織TGF-β1免疫組化法染色(×400)

3 討 論

AD病理特征主要為神經(jīng)元外的Aβ聚集形成老年斑，神經(jīng)元內(nèi)tau蛋白異常聚集形成神經(jīng)原纖維纏結(jié)，腦皮質(zhì)及海馬膽堿能神經(jīng)元及其突觸大量丟失，累及的皮質(zhì)動脈出現(xiàn)血管淀粉樣變性〔6〕。目前大腦的持續(xù)性炎性反應(yīng)已被公認(rèn)為AD的重要病理表現(xiàn)〔7，8〕，研究也表明炎性反應(yīng)在AD發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用〔9，10〕。

細胞因子是由免疫原、絲裂原或其他因子刺激細胞所產(chǎn)生的低分子質(zhì)量可溶性蛋白質(zhì)，具有調(diào)節(jié)固有免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答，促進造血、刺激細胞活化、增殖和分化等功能〔11〕。細胞因子按照對機體的效應(yīng)可分為促炎因子和抗炎因子兩大類。在促炎因子中，TNF-α是具有廣泛生物學(xué)效應(yīng)的細胞因子，可以誘導(dǎo)其他前炎性細胞因子及炎性相關(guān)蛋白表達，IL-1β是炎癥免疫反應(yīng)初始調(diào)控因子，以誘發(fā)炎性反應(yīng)及機體防御反應(yīng)為主。Aβ可持續(xù)激活小膠質(zhì)細胞，并過量表達炎癥因子TNF-α、IL-1β等，TNF-α反饋性刺激小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞分泌更多的炎癥因子，如TNF-α、IL-6、IFN-γ，在促成與放大炎性級聯(lián)反應(yīng)的過程中，AD 患者腦中不可避免形成慢性炎性效應(yīng)〔12〕。 研究發(fā)現(xiàn)單獨的TNF-α不影響淀粉樣前體蛋白(APP)的產(chǎn)生和代謝，但IFN-γ可誘導(dǎo)APP的轉(zhuǎn)錄和翻譯，使APP 釋放增多；TNF-α對小膠質(zhì)細胞Aβ1～42 趨化受體表達的上調(diào)作用加劇了Aβ過度生成，從而加速AD病理進程。臨床上發(fā)現(xiàn) AD患者血液和腦脊液中IL-1β和TNF-α水平升高〔6，13〕，已不懷疑IL-1β和 TNF-α可能為介導(dǎo)AD炎癥病理反應(yīng)的關(guān)鍵因子， 本實驗也得出了一致的結(jié)果。IFN-γ主要來源于T淋巴細胞，是一個促炎性細胞因子，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中，IFN-γ除已知的促炎和破壞效果也是一個保護性和調(diào)節(jié)性的細胞因子〔14〕。臨床研究發(fā)現(xiàn)〔15〕AD患者隨著病情的加重，血清IFN-γ水平存在逐漸增高的趨勢。同樣有實驗觀察到AD大鼠腦內(nèi)IFN-γ表達明顯增加〔16〕。

在抗炎因子中IL-4、IL-10是膠質(zhì)細胞分泌的主要免疫抑制性細胞因子。Aβ1～42刺激會引起腦免疫細胞釋放IL-4，后者能為神經(jīng)干細胞提供危險信號〔17〕，而 IL-10在維持神經(jīng)元穩(wěn)態(tài)和能量代謝平衡、細胞存活等方面發(fā)揮重要作用〔18〕。已知AD患者血清和腦脊液中炎性因子水平與病情嚴(yán)重程度相關(guān)，其中IL-10尤其與Aβ42、Aβ42/p-tau比值呈明顯負相關(guān)〔19，20〕，提示血清IL-10水平可作為判斷腦內(nèi)Aβ沉積的標(biāo)志物。也說明AD不是單純的腦部神經(jīng)炎癥，腦炎癥因子可能穿過血腦屏障引發(fā)外周炎癥。TGF-β1是TGF-β的一種亞單位，是由活化的T細胞和單核-巨噬細胞產(chǎn)生的細胞因子。研究〔21〕發(fā)現(xiàn)預(yù)先腦室內(nèi)注射外源性TGF-β1，能夠預(yù)防海馬注射 Aβ1～42誘導(dǎo)的 AD認(rèn)知功能損害，可能與TGF-β1能夠抑制膠質(zhì)細胞和T細胞介導(dǎo)的神經(jīng)炎性反應(yīng)有關(guān)。

本研究表明，電針能夠調(diào)節(jié)中樞和外周抗炎因子IL-4、IL-10、TGF-β1與促炎因子TNF-α、IFN-γ、IL-1β的失衡狀態(tài)，且炎性因子在中樞和外周的變化趨勢基本一致。提示AD的腦內(nèi)炎性物質(zhì)和外周炎性物質(zhì)相互作用，雖然有血腦屏障存在，但是這一類炎性小分子可能很容易穿過血腦屏障，至于哪一方占主導(dǎo)因素，根據(jù)當(dāng)前的實驗結(jié)果尚不足以闡明。

中醫(yī)認(rèn)為“正氣存內(nèi)、邪不可干”，從某種角度看，慢性炎癥似乎相當(dāng)于人體邪正斗爭的相持狀態(tài)，當(dāng)人體正氣充足時，Aβ被清除能力增強，抗炎保護效應(yīng)占優(yōu)勢，則抗炎因子水平升高；當(dāng)人體正氣不足時，Aβ清除減少，促炎破壞效應(yīng)占優(yōu)勢，則促炎因子水平升高。炎癥失衡相當(dāng)于AD將病而未病的狀態(tài)，中醫(yī)講究治病必求于本，因此，延緩AD病程的關(guān)鍵在于提高患者的正氣。最近的研究逐步轉(zhuǎn)向固有免疫(先天免疫)紊亂導(dǎo)致膠質(zhì)細胞清除Aβ障礙，而不再單純局限于從神經(jīng)炎癥的角度來考察AD，把對AD的認(rèn)識提高到一個較宏觀的視角，與中醫(yī)的整體觀念有異曲同工之妙。 綜上，AD大鼠腦內(nèi)存在慢性神經(jīng)炎性反應(yīng)，在外周也伴隨著慢性炎性反應(yīng)的進展，電針能夠有效改善AD癥狀，可能與改善抗炎/促炎的失衡狀態(tài)有關(guān)。由于AD神經(jīng)炎癥與多種炎性細胞因子相關(guān)，因此，闡明各炎癥因子的作用及抗炎因子與促炎因子的相互關(guān)系也是進一步研究的方向。