孫哲宇 樸春麗 米佳 姜曉天 唐程 王麗

(1長春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林 長春 130117；2廣州中醫(yī)藥大學(xué)深圳醫(yī)院(福田)；3長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科)

近年來，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)引起2型糖尿病(T2DM)發(fā)生發(fā)展已受到醫(yī)學(xué)界廣泛關(guān)注〔1～3〕。相關(guān)研究認(rèn)為，ERS通過肌醇依賴酶(IRE)1激活相關(guān)通路誘導(dǎo)胰島素抵抗(IR)和胰島β細(xì)胞凋亡〔4～6〕。解毒通絡(luò)調(diào)肝方是樸春麗教授臨床治療T2DM的常用有效方劑，課題組前期相關(guān)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，本方可通過多靶點(diǎn)、多條通路改善IR及保護(hù)胰島β細(xì)胞功能〔7～9〕。本研究采用解毒通絡(luò)調(diào)肝方干預(yù)T2DM大鼠模型，觀察肝臟組織ERS相關(guān)因子IRE1α及其磷酸化蛋白的表達(dá)，進(jìn)一步探討本方改善IR及保護(hù)胰島β細(xì)胞的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物 選擇SPF級9周齡健康、雄性的ZDF大鼠88只和ZL大鼠10只(購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物有限公司，許可證號：SCXK京2014-0003)。飼養(yǎng)于環(huán)境溫度(24±1)℃，濕度為55%±5%的潔凈動物房(北京文慧凈化設(shè)備廠)內(nèi)，每日光照黑暗12 h/12 h循環(huán)，所有大鼠均自由飲用普通自來水。采用高脂顆粒飼料Purina #5008(購自上海介宏貿(mào)易有限公司)飼養(yǎng)ZDF大鼠，維持普通飼料#1022(購自北京華阜康生物科技股份有限公司)飼養(yǎng)ZL大鼠。

1.2實(shí)驗(yàn)主要試劑 一抗：IRE1-抗IRE1抗體、p-IRE1-抗IRE1(phospho S724)抗體及二抗羊抗兔IgG均購自Abcam 公司；二抗磷酸二氫鈉購自西隴化工廠，磷酸氫二鈉、檸檬酸、甲醇、30%過氧化氫均購自北京化工廠；山羊血清購自中杉金橋，Triton購自Sigma；二辛尼可酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天研究有限公司，化學(xué)發(fā)光液購自北京普利萊生物技術(shù)有限公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1造模、分組及給藥 以隨機(jī)血糖≥11.1 mmol/L作為T2DM成模標(biāo)準(zhǔn)，動態(tài)觀察88只ZDF大鼠隨機(jī)血糖及體重變化〔10〕。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行至第13周時，成功制備ZDF大鼠T2DM模型59只，并將成模的ZDF大鼠按體重和血糖水平分層，隨機(jī)分為模型組15只、西藥組11只、中藥低、中、高劑量組各11只，空白對照組為ZL大鼠10只。第13周給予各組大鼠為期4 w的灌胃治療。解毒通絡(luò)調(diào)肝方(中藥來源：長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院制劑室，4℃冰箱保存)由榛花、大黃、黃連、雙花、黃芪、丹參、柴胡構(gòu)成，灌胃前根據(jù)所含原藥材量計算，中藥低、中、高劑量組分別用相應(yīng)劑量蒸餾水稀釋，灌胃劑量分別為1、3、5 g/(kg·d)；西藥組用陽性對照藥鹽酸二甲雙胍片，購自天津太平洋制藥有限公司(國藥準(zhǔn)字：批號 080313)，灌胃前將其完全溶解后用蒸餾水稀釋，灌胃劑量為0.5 g/(kg·d)；模型組與空白對照組使用等體積蒸餾水每天灌胃1次。

1.3.2標(biāo)本采集 各組大鼠灌胃治療第17周，乙醚麻醉，快速提取肝臟組織，迅速放入液氨保存，用于Western印跡檢測IRE1α及磷酸化(p)-IRE1α蛋白的表達(dá)水平。

1.3.3檢測方法 分別將IRE1α、p-IRE1α一抗?jié)舛葏⒄?∶325、1∶90稀釋；二抗?jié)舛葏⒄?∶1 000稀釋。具體步驟：取肝組織約50 mg，在冰凍緩沖液中研碎，加入去污劑蛋白裂解液(含苯甲基磺酰氟) 400 μl進(jìn)行總蛋白的提取，用BCA蛋白濃度試劑盒測定樣本蛋白的濃度，取含蛋白40 μg的溶液體積為上樣量，加入樣品處理液，煮沸7～10 min，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)120 min后轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，室溫下用5%脫脂奶粉(脫脂奶粉+TBST緩沖液) 封閉1.5 h；洗膜后依次加一抗及二抗孵育、漂洗；將普利萊化學(xué)發(fā)光液A液和B液約1 ml充分混勻后鋪于膜正面，室溫1～3 min后，去除膜表面的殘液，置于曝光盒中曝光、顯影、定影。用Quantity One軟件掃描各條帶的吸光度(A值)并分析結(jié)果，GAPDH作為內(nèi)參照進(jìn)行半定量分析。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS20.0軟件行非參數(shù)檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

各組肝臟IRE1α、p-IRE1α蛋白的表達(dá)水平，各組大鼠肝臟組織內(nèi)均有IRE1α、p-IRE1α蛋白表達(dá)，與空白對照組相比，其余各組肝臟IRE1α、p-IRE1α蛋白表達(dá)均顯著上調(diào)(P<0.01)。與模型組比較，各藥物組肝臟組織IRE1α、p-IRE1α蛋白表達(dá)水平均有不同程度下降，且各藥物組中，中藥高劑量組下調(diào)最為明顯(P<0.01)。IRE1α蛋白的表達(dá)水平以中藥高、中、低劑量組下降最顯著(P<0.01)，西藥組IRE1α蛋白表達(dá)水平雖有下降，但與模型組相比無明顯意義(P>0.05)。與模型組相比，西藥組、中藥中、高劑量組p-IRE1α蛋白表達(dá)水平均明顯下調(diào)(P<0.01)，中藥高劑量組p-IRE1α蛋白表達(dá)與其他治療組比較下調(diào)最為明顯(P<0.01)，西藥組下降水平與中藥中劑量組相當(dāng)(P>0.05)，中藥低劑量組表達(dá)雖有減少，但與模型組比較無明顯意義(P>0.05)。見表1、圖1。

表1 各組大鼠肝臟組織IRE1α、p-IRE1α蛋白表達(dá)(OD值，

與空白對照組相比:1)P<0.01，與模型組相比:2)P<0.01；與西藥組相比:3)P<0.01，4)P<0.05

1.空白對照組；2.模型組；3.西藥組；4.中藥低劑量組；5.中藥中劑量組；6.中藥高劑量組圖1 各組肝臟組織IRE1α、p-IRE1α蛋白的表達(dá)

3 討 論

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)是相關(guān)蛋白合成的細(xì)胞位點(diǎn)，在蛋白質(zhì)合成、折疊和轉(zhuǎn)運(yùn)，鈣離子穩(wěn)態(tài)和脂質(zhì)合成中起著重要作用。鈣離子穩(wěn)態(tài)失衡、缺氧、高糖應(yīng)激等刺激可干擾ER中蛋白質(zhì)的折疊過程，導(dǎo)致ERS并引發(fā)未折疊的蛋白質(zhì)反應(yīng)。短時間的ERS可以促進(jìn)蛋白質(zhì)有效折疊及細(xì)胞自身保護(hù)，但持續(xù)的ERS則觸發(fā)相關(guān)通路引發(fā)IR和細(xì)胞凋亡。ERS與IR和胰島β細(xì)胞凋亡緊密相關(guān)，受到醫(yī)學(xué)界的廣泛關(guān)注，緩解ERS可能是治療T2DM的一個新靶點(diǎn)〔1～3〕。

IRE1是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的感應(yīng)蛋白之一，IRE1α作為其異構(gòu)體廣泛存在于哺乳動物的細(xì)胞中，正常情況下與ER伴侶分子結(jié)合免疫球蛋白(BiP)/葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白(GRP)78緊密結(jié)合，而在ERS的情況下，BiP/GRP78 和IRE1α解離釋放。具有激酶活性的IRE1α自身磷酸化形成p-IRE1α，具有核酸內(nèi)切酶活性的IRE1α則剪切X盒結(jié)合蛋白(XBP)1 mRNA生成具有轉(zhuǎn)錄活性的XBP1s，調(diào)控相關(guān)基因促進(jìn)細(xì)胞存活〔11〕；但持續(xù)的ERS時，IRE1α-XBP-1通路可直接引起IR；p-IRE1α則通過介導(dǎo)c-jun N端激酶(JNK)和IκB激酶(IKK)通路進(jìn)一步使胰島素受體底物(IRS)-1絲氨酸磷酸化，抑制胰島素受體信號傳導(dǎo)，同時上調(diào)炎癥因子的表達(dá)，出現(xiàn)組織內(nèi)的炎癥反應(yīng)，促使ERS引起IR〔4〕；此外，IRE1α通過激酶的作用招募腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子(TRAF)2與凋亡信號調(diào)節(jié)激酶(ASK1)結(jié)合成復(fù)合物IRE-TRAF2-ASK1，該復(fù)合物可激活JNK通路介導(dǎo)細(xì)胞凋亡途徑〔5〕；亦有研究證明，IRE1α可不依賴于JNK途徑而直接介導(dǎo)BH3交叉域死亡受體激動劑(Bid)激活B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2相關(guān)X蛋白(Bax)和其同系拮抗因子(Bak)，從而啟動線粒體凋亡途徑〔6〕。

解毒通絡(luò)調(diào)肝方由榛花、大黃、黃連、雙花、黃芪、丹參、柴胡組成，是樸春麗教授總結(jié)多年臨床經(jīng)驗(yàn)所組，也因此創(chuàng)立了解毒通絡(luò)調(diào)肝之根本大法。全方重在解毒，活血化瘀、疏經(jīng)通絡(luò)亦有側(cè)重，清熱、祛濕、化濁兼顧，扶正祛邪貫穿始終，隨癥加減立足于根本。肝失疏泄、升降失司乃本病之因，因此產(chǎn)生的痰、濕、濁、瘀、熱等日久膠結(jié)謂之“毒邪”，此乃本病之態(tài)，“毒損肝絡(luò)”乃本病核心病機(jī)，因此用解毒通絡(luò)調(diào)肝之法則直中病靶，激活機(jī)體排毒能力，攻補(bǔ)兼施、扶正祛邪，通暢絡(luò)脈，推陳出新，謂之“正本以求源”。

本研究結(jié)果顯示，ZDF 大鼠經(jīng)Purina #5008高脂飼養(yǎng)誘導(dǎo)形成的T2DM動物模型存在ERS；經(jīng)解毒通絡(luò)調(diào)肝方干預(yù)后，IRE1α、p-IRE1α蛋白表達(dá)水平均下調(diào)，其中，高劑量組下調(diào)最為明顯。綜上所述，本方可能通過調(diào)節(jié)IRE1介導(dǎo)的相關(guān)信號通路緩解ERS、改善IR和保護(hù)胰島β細(xì)胞，并再次驗(yàn)證了“毒損肝絡(luò)”乃T2DM的病理基礎(chǔ)，解毒通絡(luò)調(diào)肝為其治療大法，至于IRE1介導(dǎo)的具體相關(guān)信號通路有待后續(xù)進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。