程新宇 周成美 孫潔 王翠芳

(1沈陽醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院病理科，遼寧 沈陽 110024；2錦州醫(yī)科大學(xué))

自噬相關(guān)蛋白p62由C-Myc編碼，是在細(xì)胞質(zhì)中合成、定位于細(xì)胞核的一種多功能泛素化結(jié)合蛋白〔1〕，具有選擇性自噬功能，可在一定程度上反映自噬活性〔2〕。近年來隨著研究的不斷深入，研究者發(fā)現(xiàn)p62參與了包括自噬在內(nèi)的眾多生命活動(dòng)信號(hào)通路〔3〕，其表達(dá)和調(diào)控異常與多種惡性腫瘤密切相關(guān)〔4〕；增殖指數(shù)(Ki-67)是細(xì)胞增殖的重要標(biāo)志，?？勺鳛轭A(yù)測惡性腫瘤發(fā)展及預(yù)后的指標(biāo)。本文主要探討p62和Ki-67表達(dá)與乳腺浸潤性導(dǎo)管癌患者臨床病理特征的關(guān)系，為乳腺癌治療及預(yù)后提供新的研究靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1標(biāo)本來源 選取2015年1月至2017年12月沈陽醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院病理科79例乳腺浸潤性導(dǎo)管癌標(biāo)本為實(shí)驗(yàn)組，20例相應(yīng)距腫瘤組織5 cm以上的癌旁正常乳腺組織標(biāo)本為對照組，所有患者臨床病理資料存檔完整。患者年齡30～78歲，中位年齡58歲；腫瘤直徑<2 cm 16例，≥2 cm 63例；組織學(xué)分級(jí)Ⅰ級(jí)2例，Ⅱ級(jí)54例，Ⅲ級(jí)23例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移33例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移46例。患者行免疫組織化學(xué)檢測時(shí)均未行放化療。

1.2主要試劑 通用型p62鼠抗人單克隆抗體購自美國Abcam 公司；Ki-67即用型鼠抗人單克隆抗體、鏈霉菌抗生素-過氧化物酶連接法(SP)試劑盒及二氨基聯(lián)苯胺(DAB)均購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.3SP法免疫組織化學(xué)染色 乳腺浸潤性導(dǎo)管癌患者腫物切除后均使用10%中性甲醛固定，依據(jù)病理規(guī)定規(guī)范取材，石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片，常規(guī)石蠟脫水，檸檬酸抗原修復(fù)(pH6.0)、高壓修復(fù)，室溫冷卻30 min；用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS，pH7.4)沖洗3次，每次3 min，用油筆圈定玻片上的待測組織區(qū)域；每張切片滴加過氧化酶阻斷試劑3%H2O2(試劑A)，室溫下孵育10 min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性，PBS沖洗3次，每次3 min；每張切片滴加非免疫動(dòng)物血清(試劑B)，室溫下孵育10 min；除去血清，每張切片滴加第一抗體p62(稀釋比1∶200)或Ki-67 4℃冰箱冷藏過夜；PBS沖洗3次，每次3 min，每張切片加生物素標(biāo)記的第二抗體(試劑C)室溫下孵育10 min，PBS沖洗3次，每次3 min；每張切片滴加鏈霉菌抗生物素-過氧化物酶溶液(試劑D)，室溫下孵育10 min，PBS沖洗3次，每次3 min；每張切片滴加新鮮配制的DAB，顯微鏡下觀察3～10 min。自來水沖洗，蘇木素復(fù)染，PBS或自來水沖洗返藍(lán)，切片經(jīng)梯度酒精脫水，二甲苯透明后，中性樹膠封固。使用PBS代替一抗作陰性對照，用已知陽性乳腺癌標(biāo)本切片作陽性對照。

1.4結(jié)果判讀 免疫組化切片均由兩位經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)師采用雙盲法單獨(dú)判讀。(1)p62 陽性結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)：p62陽性表達(dá)為出現(xiàn)棕黃色顆粒，并定位于細(xì)胞質(zhì)。(2)Ki-67陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)：陽性表達(dá)定位于細(xì)胞核。在高倍鏡下任意計(jì)數(shù)5個(gè)視野，每次選取200個(gè)細(xì)胞進(jìn)行觀察，按陽性細(xì)胞所占百分比計(jì)分，評分標(biāo)準(zhǔn)〔5〕:0分為無陽性細(xì)胞；1分為陽性細(xì)胞<10%；2分為陽性細(xì)胞10%～30%；3分為陽性細(xì)胞>30%。按染色強(qiáng)度計(jì)分：不著色為0分；淡黃色計(jì)1分；黃色計(jì)2分；棕黃色計(jì)3分。陽性細(xì)胞百分比計(jì)分與染色強(qiáng)度計(jì)分的乘積:0～2分為陰性，3～9分為陽性。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0軟件行χ2檢驗(yàn)，關(guān)聯(lián)性分析采用Spearman 等級(jí)相關(guān)分析。

2 結(jié) 果

2.1p62和Ki-67在乳腺組織中表達(dá) 實(shí)驗(yàn)組p62陽性表達(dá)率為58.2%(46/79)，明顯高于對照組10.0%(2/20；χ2=6.532,P=0.011)；Ki-67陽性表達(dá)率為51.9%(41/79)，明顯高于對照組5.0%(1/20；χ2=7.389,P=0.007)。見圖1。

2.2p62和Ki-67表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 實(shí)驗(yàn)組中，p62和Ki-67陽性率均與組織學(xué)分級(jí)相關(guān)，且組織學(xué)分級(jí)越高，兩者陽性率越高；p62陽性率與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。見表1。

p62陽性

p62陰性

Ki-67 陽性

Ki-67陰性

臨床病理特征n p62+ -χ2值P值Ki-67+-χ2值P值年齡(歲) ≤605131 200.3870.53430212.7640.096 >602815 131117淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 是332679.8470.00217160.0030.954 否4620262422腫瘤直徑 <2 cm16791.7290.189970.1520.696 ≥2 cm633924 3231組織學(xué)分級(jí) Ⅰ、Ⅱ級(jí)5628285.3540.021193724.882 0.000 Ⅲ級(jí)23185 221

2.3p62和Ki-67相關(guān)性分析 p62和Ki-67共同陽性表達(dá)30例，共同陰性表達(dá)22例；p62陰性表達(dá)而Ki-67陽性表達(dá)11例；p62陽性表達(dá)而Ki-67陰性表達(dá)16例。p62和ki-67表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.315,P=0.005)。

3 討 論

乳腺浸潤性導(dǎo)管癌是乳腺癌中最常見且惡性程度較高的一種病理類型，發(fā)病率呈逐年上升趨勢。自噬是細(xì)胞在生理狀態(tài)下適應(yīng)環(huán)境的一種保護(hù)機(jī)制，自噬異常參與了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展等病理過程〔6〕。自噬相關(guān)蛋白p62是一種支架蛋白。自噬發(fā)生時(shí)，p62首先與細(xì)胞質(zhì)中泛素化蛋白結(jié)合，再與定位于自噬體內(nèi)膜上的微管相關(guān)蛋白輕鏈3(LC3B)形成復(fù)合物，被自噬溶酶體降解；自噬過程中，p62蛋白在細(xì)胞質(zhì)中不斷被降解，自噬被抑制時(shí)，p62蛋白在細(xì)胞質(zhì)中不斷積累，因此p62可作為反映自噬活性的標(biāo)記蛋白。雷程等〔7〕研究表明，p62蛋白在結(jié)腸癌組織細(xì)胞質(zhì)中陽性表達(dá)明顯高于癌旁正常組織，p62高表達(dá)提示自噬活動(dòng)減弱，促進(jìn)腫瘤發(fā)展；劉婷婷等〔8〕研究發(fā)現(xiàn)p62在外陰鱗狀細(xì)胞癌的細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)明顯高于外陰的正常皮膚，說明外陰鱗狀細(xì)胞癌自噬活動(dòng)減弱促進(jìn)了癌的發(fā)生，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。p62異常聚集表明乳腺浸潤性導(dǎo)管癌自噬活性顯著減弱，自身受損、變性或衰老細(xì)胞器和大分子物質(zhì)得不到及時(shí)降解，導(dǎo)致活性氧大量產(chǎn)生，使乳腺正常組織DNA損傷，促使正常乳腺組織向乳腺浸潤性導(dǎo)管癌進(jìn)一步轉(zhuǎn)化。

以往研究提示細(xì)胞內(nèi)p62異常聚集能激活雷帕霉素靶蛋白(mTOR)癌基因信號(hào)，反向調(diào)節(jié)自噬，起到促癌作用〔9〕；近年來發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)p62異常聚集還可以激活核因子(NF)-κB和核因子相關(guān)因子(Nrf)2兩個(gè)系統(tǒng)〔10〕。p62蛋白通過T6BD與腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子(TRAF)6相互作用促進(jìn)TRAF6寡聚化，從而導(dǎo)致TRAF6多聚泛素化及NF-κB〔11〕活化。NF-κB是一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子蛋白家族，涉及細(xì)胞存活及分化，NF-κB信號(hào)途徑激活對于腫瘤細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移非常重要；Nrf2是細(xì)胞內(nèi)最重要的抗氧化應(yīng)激調(diào)控通路因子，可穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)環(huán)境〔12〕。當(dāng)氧化應(yīng)激持續(xù)存在時(shí)，p62與Nrf2競爭結(jié)合腫瘤抑制因子(Keap)1，使Nrf2入核，從而激活Nrf2靶基因轉(zhuǎn)錄，保護(hù)腫瘤細(xì)胞免受氧化性損傷，使癌細(xì)胞生存能力增強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，p62表達(dá)與腫瘤的惡性行為相關(guān)，其高表達(dá)預(yù)示惡性程度高，易發(fā)生轉(zhuǎn)移，是預(yù)后差的指標(biāo)。Burdelski等〔13〕使用免疫組化技術(shù)檢測了前列腺癌組織中p62的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)與組織學(xué)分級(jí)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，其結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)相似。Ki-67是一種與細(xì)胞增殖密切相關(guān)的核抗原，是評價(jià)惡性腫瘤細(xì)胞增殖程度最可靠的指標(biāo)。在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織中Ki-67的高表達(dá)可提示腫瘤細(xì)胞增殖活躍，侵襲力強(qiáng)，易發(fā)生轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差。乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織中p62和Ki-67表達(dá)呈顯著正相關(guān),表明兩者共同促進(jìn)腫瘤發(fā)生；且兩者高表達(dá)預(yù)示腫瘤惡性程度高、侵襲力強(qiáng)，易發(fā)生轉(zhuǎn)移；有希望成為判斷乳腺浸潤性導(dǎo)管癌預(yù)后的有力指標(biāo)。