劉彤媌 宋卓 王玫紅 趙煥

(齊齊哈爾醫(yī)學院附屬第三醫(yī)院呼吸一科，黑龍江 齊齊哈爾 161000)

腫瘤免疫研究表明，免疫抑制是腫瘤的主要特征之一，T細胞介導的腫瘤抗原識別、提呈及活化在腫瘤免疫應答中具有重要意義〔1〕。協(xié)同刺激分子包括共刺激分子和共抑制分子，負責提供T細胞活化所需的第二信號。程序性細胞死亡蛋白(PD)-1是目前研究較多的共抑制分子，與相應配體結合后，對T 細胞的激活發(fā)揮負調(diào)節(jié)作用。GPC1是一種廣泛存在的蛋白聚糖大分子，為肝素結合生長因子的共受體，與HBGFs促細胞有絲分裂活動有關。研究發(fā)現(xiàn) GPC1在胰腺癌、乳腺癌及神經(jīng)膠質(zhì)瘤中均有高表達〔2〕。本研究通過分析非小細胞肺癌(NSCLC)患者GPC1和PD-1的表達情況，探討其與NSCLC發(fā)生發(fā)展及預后的相關性。

1 資料與方法

1.1臨床資料 選取2010年1月至2012年1月齊齊哈爾醫(yī)學院附屬第三醫(yī)院收治的70例NSCLC患者為患者組，均經(jīng)病理診斷證實。根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)標準進行病理學檢查，并根據(jù) TNM 國際分期法(UICC，2009)進行分期。男42例，女28例，年齡37～71歲，平均(52.4±5.8)歲；鱗癌45例，腺癌25例；TNM分期：Ⅰ期18例，Ⅱ期21例，Ⅲ期24例，Ⅳ期7例。另取同期來院體檢的健康人群30例為對照組，男17例，女13例，年齡35～76歲，平均(56.7±6.6)歲。兩組性別、年齡等相比無顯著性差異(P>0.05)，具有可比性。

1.2方法 兩組空腹采集肘靜脈血5 ml，3 000 r/min離心15 min，取上層血漿，置于EP管中并做好標記，采用Elivison二步法檢測血清中GPC1和PD-1水平，一抗4℃過夜孵育，室溫下與二抗結合30 min，切片采用DAB顯色，蘇木精復染。采用ABCOM公司的PD-1鼠抗人單克隆抗體(1∶100稀釋)及GPC1試劑盒進行檢測。對70例患者進行術后隨訪，隨訪時間從手術結束后開始，至2017年1月，觀察患者是否出現(xiàn)復發(fā)或轉(zhuǎn)移，比較GPC1和PD-1陰性表達組與陽性表達組患者的生存率，分析GPC1和PD-1與疾病預后的相關性。

1.3質(zhì)量控制 納入標準：(1)患者均有影像學和病理學資料證實為原發(fā)NSCLC；(2)所有患者知情同意并且簽署知情同意書。排除標準：(1)復發(fā)腫瘤或者多重癌；(2)患者存在嚴重感染；(3)并發(fā)血液系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)病變者。質(zhì)量控制要求：(1)根據(jù)納入、排除標準嚴格篩選入組病例。(2)所有病例術前未接受過放化療，未使用糖皮質(zhì)激素及非甾體類藥物；術中癌組織和癌旁組織病理標本齊全；半年內(nèi)體重減輕<10%，術后無嚴重并發(fā)癥；Ⅰ期患者至復發(fā)后才接受全身化療，Ⅱ、Ⅲ期患者術后接受過至少2個周期含鉑方案的聯(lián)合化療或放療。(3)根據(jù)試劑說明書和預實驗結果確定最佳的試劑稀釋濃度及抗原修復方法。(4)免疫組化染色過程中設立陰性對照。(5)使用前調(diào)校實驗相關儀器，準確控制實驗溫度及時間。(6)實驗結果采用盲法進行判定。

1.4統(tǒng)計學分析 采用SPSS20.0軟件，計量資料組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗；采用Kaplan-Meier(K-M)生存分析法比較陽性組與陰性組患者的生存情況。

2 結 果

2.1兩組GPC1、PD-1陽性率比較 患者組GPC1、PD-1陽性率分別為80.0%(56例)與72.9%(51例)，遠高于對照組的10.0%(3例)與6.7%(2例)，差異具有統(tǒng)計學意義(χ2=42.538,39.935;均P<0.05)。

2.2GPC1、PD-1表達與患者臨床病理參數(shù)的關系 GPC1、PD-1陽性表達與的TNM分期及淋巴結轉(zhuǎn)移情況密切相關(P<0.05)，與患者的性別、年齡、病理分型無明顯相關性(P>0.05)。見表1。

表1 GPC1、PD-1表達與患者臨床病理參數(shù)的關系(n)

2.3GPC1陽性組和陰性組生存時間比較 隨訪患者時間最短8個月，最長60個月。GPC1陽性組中位生存時間31.0個月，3年、5年累計生存率分別為32.1%(18例)和7.1%(4例)；GPC1陰性組中位生存時間54.5個月，與陽性組比較差異顯著(K-M生存分析χ2=5.42，P=0.019 9)；GPC1陰性組3年、5年累計生存率分別為64.3%(9例)與35.7%(5例)，均高于PD-1陽性組(χ2=4.45，5.81；均P<0.05)。見圖1。

2.4PD-1陽性組和陰性組生存時間比較 PD-1陽性組中位生存時間29.0個月，其3年、5年累計生存率分別為31.4%(16例)和7.8%(4例)；PD-1陰性組中位生存時間51.0個月，3年、5年累計生存率分別為68.4%(13例)與31.6%(6例)，組間比較PD-1陰性組的生存時間(K-M生存分析χ2=10.82，P=0.001)及3、5年累計生存率均高于PD-1陽性組(χ2=7.83,4.58;均P<0.05)。見圖2。

2.5生存時間影響因素分析 TNM分期、淋巴結轉(zhuǎn)移、GPC1陽性及PD-1陽性是NSCLC患者生存時間的影響因素。見表2。

圖1 GPC1陽性組和陰性組生存率比較

圖2 PD-1陽性組和陰性組生存率比較

影響因素BS.E.P值95% CITNM分期0.7830.1060.0000.588 7～1.011 3淋巴結轉(zhuǎn)移0.8730.1460.0000.509 1～1.090 9GPC1陽性0.6840.1220.0001.068 2～1.946 4PD-1陽性0.6910.1260.0001.084 4～1.957 8

3 討 論

肺癌的發(fā)病率和死亡率在全球惡性腫瘤范圍內(nèi)均居首位，每年約新增病例130萬例。大部分患者在發(fā)現(xiàn)時已屬晚期，錯過最佳治療時機，因此尋找早期敏感的診斷指標一直為人們所關注〔3〕。

PD-1多表達于活化T細胞表面，與相關配體PD-L1結合后為T細胞提供抑制性第二信號，使T細胞信號通路上的轉(zhuǎn)錄因子去磷酸化失活，從而抑制T細胞的活化增殖和白細胞介素(IL)-10、干擾素(IFN)-γ等細胞因子的產(chǎn)生，發(fā)揮免疫自穩(wěn)功能，避免免疫激活帶來的機體損傷，這也成為腫瘤細胞逃避免疫系統(tǒng)攻擊的主要機制之一〔4〕。目前研究已證實，PD-1在肺癌、乳腺癌、黑色素瘤等多種惡性腫瘤組織中高表達，且與患者的預后相關〔5，6〕。本研究結果顯示，GPC1、PD-1高表達與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預后均具有相關性。GPC1是硫酸乙酰肝素蛋白多糖(HSPGs)家族的成員之一，通過糖基磷脂酰肌醇附著于細胞膜表面，與腫瘤細胞的增殖、轉(zhuǎn)移和血管生成有關，在多種腫瘤細胞上高表達〔7〕。GPC1多附著于細胞膜表面，因此之前研究結論也均是基于組織或細胞獲得的〔8〕。外泌體是在多泡體內(nèi)形成的小囊泡，可通過胞吐釋放至血液、尿液等多種體液中，外泌體膜表面分布的蛋白與其來源細胞的分子指紋和細胞狀態(tài)帶有契合性，且可通過非侵入性途徑檢測到。已有報道在胰腺癌患者的血清中檢測到了GPC1陽性的外泌體，提示外泌體膜蛋白GPC1檢測可作為腫瘤診斷的一種便捷手段〔9〕。本研究結果顯示GPC1、PD-1在NSCLC組織中表達增加，并提示腫瘤惡性程度高、預后不良，可作為判斷患者預后的指標，為NSCLC的治療提供了新靶點。