廖鑫 曾憲東 林建飛 李楠洋 王翠芳 吳非 白陽(yáng) 程新宇 欒嵐

(沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院 1基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院研究生院，遼寧 沈陽(yáng) 110034；2附屬中心醫(yī)院病理科)

在西方國(guó)家，結(jié)直腸癌是癌癥死亡的第2大原因，最新的全球癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，在亞洲地區(qū)結(jié)直腸癌的發(fā)生呈上升態(tài)勢(shì)〔1～3〕。在中國(guó)，結(jié)直腸癌是癌癥死亡的第5大原因，在經(jīng)濟(jì)較發(fā)達(dá)的城市比例更高〔4〕。目前，結(jié)直腸癌的治療手段包括手術(shù)、化療、放療，其中以手術(shù)治療為主，但仍有20%～30%的患者出現(xiàn)病情復(fù)發(fā)。Diversin是果蠅屬Diego蛋白在哺乳動(dòng)物中的同系物〔5，6〕。研究發(fā)現(xiàn)在新生小鼠和成鼠腦內(nèi)，Diversin表達(dá)于室下區(qū)和海馬區(qū)的神經(jīng)母細(xì)胞和成熟神經(jīng)元，并證實(shí)Diversin可促進(jìn)其增殖活性〔7〕。近年來(lái)課題組發(fā)現(xiàn)Diversin在非小細(xì)胞肺癌中高表達(dá)，對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展起促進(jìn)作用〔8〕。目前尚未見(jiàn)Diversin 在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)的報(bào)道。本研究檢測(cè)結(jié)直腸癌及癌旁組織中Diversin 的表達(dá)及與臨床病理參數(shù)的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1臨床資料 收集沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院病理科2010～2011年經(jīng)手術(shù)切除病理證實(shí)為結(jié)直腸癌的蠟塊標(biāo)本51例(結(jié)直腸癌組)，男35例，女16例，年齡33～87歲。結(jié)腸癌28例，直腸癌23例，高分化病人36例 ，中低分化病人15例，分期標(biāo)準(zhǔn)參照國(guó)際抗癌聯(lián)盟(UICC)的 TNM 標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ～Ⅱ期31例，Ⅲ～Ⅳ期20例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移24例，所有患者術(shù)前未接受新輔助治療。本研究經(jīng)沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院當(dāng)?shù)貦C(jī)構(gòu)審查委員會(huì)批準(zhǔn)。同時(shí)收集了來(lái)自相同患者的51例相鄰組織標(biāo)本作為陰性對(duì)照組。

1.2主要試劑 鼠抗人Diversin 抗體(1∶400)購(gòu)自美國(guó) Santa Cruz 公司；二抗〔快捷型酶標(biāo)羊抗鼠/兔免疫球蛋白(Ig)G聚合物〕，粉劑型磷酸鹽緩沖液(PBS)，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒，粉劑型抗原修復(fù)液均購(gòu)于福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司。

1.3EnVision兩步法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色 10%的甲醛溶液固定，石蠟包埋，切片厚度4 μm，應(yīng)用蘇木精-伊紅染色，行病理診斷。用80℃烤箱對(duì)切片進(jìn)行烘烤1 h，再用乙醇脫水，應(yīng)用枸櫞酸緩沖液行高溫高壓水化修復(fù)過(guò)程，之后 PBS 洗3次，并使內(nèi)源性過(guò)氧化物酶滅活，加入一抗(1∶400)50 μl，溫度控制于4℃一夜;再用PBS洗3次，加入二抗50 μl。室溫下 DAB顯色，PBS 洗3次，蘇木精輕度復(fù)染，鹽酸乙醇分化后流動(dòng)清水沖洗 10 min，梯度乙醇脫水，松節(jié)油透明和樹(shù)膠行封片處理，PBS 代替一抗作為陰性對(duì)照，光鏡下觀察。

1.4結(jié)果判讀 Diversin 主要表達(dá)于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中，陽(yáng)性表達(dá)為棕黃色，由2名病理醫(yī)師進(jìn)行盲法評(píng)估，隨機(jī)選取5個(gè)100倍視野通過(guò)評(píng)估染色強(qiáng)度和每個(gè)載玻片代表性區(qū)域染色的細(xì)胞百分比，對(duì)所有載玻片進(jìn)行半定量評(píng)分。染色的細(xì)胞百分比評(píng)分為0(≤4%)、1(5%～24%)、2(25%～49%)、3(50%～74%)和4(≥75%)分。根據(jù)染色強(qiáng)度，Diversin的表達(dá)分為4個(gè)等級(jí)：0(無(wú)染色)、1(淡黃色顆粒)、2(黃色)、3(深黃色顆粒)級(jí)。將染色強(qiáng)度的分?jǐn)?shù)和每個(gè)腫瘤樣品中染色的陽(yáng)性細(xì)胞的百分比評(píng)分相乘，總分為0～12分。得分<3分認(rèn)為是陰性，≥3分被定義為陽(yáng)性。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用 SPSS22.0軟件行χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1Diversin在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá) 陰性對(duì)照組腸上皮細(xì)胞中檢測(cè)到Diversin陽(yáng)性表達(dá)率為98.0%(5/51)，結(jié)直腸癌患者Diversin陽(yáng)性表達(dá)率為80.39%(41/51)，陽(yáng)性信號(hào)主要表達(dá)于腫瘤細(xì)胞的胞質(zhì)和細(xì)胞膜中，見(jiàn)圖1。

2.2Diversin在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)與各臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系 Diversin的陽(yáng)性表達(dá)在不同分化程度、臨床分級(jí)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌患者中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

圖1 Diversin在兩組中的表達(dá)(DAB，×100)

表1 Diversin在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系(n)

3 討 論

小鼠Diversin是由712個(gè)氨基酸編碼的蛋白質(zhì)，有3個(gè)功能域，分別是包含8個(gè)錨蛋白重復(fù)序列的氨基端、與酪蛋白激酶(CKI)ε相互作用的保守中心區(qū)(第287～544氨基酸)及連接Conductin或Axin的羧基端(第583～712氨基酸)〔9〕。目前已證實(shí)氨基端錨蛋白重復(fù)序列可與Dishevelled的普列克底物蛋白(DEP)區(qū)直接結(jié)合〔10〕。Luan等〔8〕研究發(fā)現(xiàn)Diversin在非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)中過(guò)表達(dá)，NSCLC中過(guò)表達(dá)并預(yù)測(cè)其預(yù)后不良，Diversin可能通過(guò)c-Jun氨基末端激酶(JNK)途徑促進(jìn)細(xì)胞增殖和侵襲；Yu 等〔11〕研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌中存在Diversin過(guò)度表達(dá)，并與TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，結(jié)果表明，Diversin是乳腺癌進(jìn)展的重要調(diào)節(jié)因子。初瑞等〔12〕發(fā)現(xiàn)Diversin 在胃腺癌中的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)深度、腫瘤大小均呈正相關(guān)，與年齡、性別和分化程度不相關(guān)。Diversin 在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及作用機(jī)制尚未見(jiàn)報(bào)道。本文首次研究了Diversin在人類結(jié)直腸癌中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)Diversin蛋白在結(jié)直腸癌中存在高表達(dá)，并與結(jié)直腸癌的中～低分化、高分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，在結(jié)直腸癌中發(fā)揮著促癌作用。