黃珊 楊洋 孟慶雯 左琦

(海南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，海南 ?？?570102)

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病是指冠狀動脈發(fā)生動脈粥樣硬化(AS)而引起血管腔狹窄或阻塞，造成心肌缺血、缺氧或壞死而導致的心臟病，又稱為冠心病(CHD)〔1〕。AS斑塊主要由浸潤的炎癥細胞(如巨噬細胞，T細胞，樹突細胞等)介導形成，因此炎癥反應(yīng)被認為是CHD及其他AS并發(fā)癥的重要機制〔2〕。白細胞介素(IL)-23/IL-17炎癥軸是介導炎癥級聯(lián)反應(yīng)的重要信號軸，在AS與CHD的發(fā)生發(fā)展過程中起到重要調(diào)控作用〔3，4〕。其中，炎癥因子IL-23可促進Th17細胞的生存與分化，同時Th17細胞又可通過腫瘤壞死因子(TNF)炎癥通路、細胞核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB通路等分泌IL-17，從而引起炎癥反應(yīng)〔5〕。另外，IL-23可能通過影響巨噬細胞源性泡沫細胞促進AS的發(fā)生和發(fā)展〔6〕。但IL-23/IL-17調(diào)控CHD發(fā)展的具體作用機制還未見報道。本研究擬進一步探討IL-23/IL-17炎癥軸與CHD及AS之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年1～11月在海南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院行冠狀動脈造影的患者56例，排除患有自身免疫性疾病、慢性感染性疾病、肝腎功能不全者。將36例診斷為冠心病的患者分別納入穩(wěn)定性心絞痛組(18例)和不穩(wěn)定性心絞痛(18例)，另外對照組20例。穩(wěn)定性心絞痛組中男10例，女8例，年齡31～64〔平均(53±1.56)〕歲；不穩(wěn)定性心絞痛組中男9例，女9例，年齡35～68〔平均(57 ± 2.38)〕歲；對照組中男11例，女9例，年齡37～64〔平均(55 ± 2.68)〕歲。3組一般資料無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究已得到倫理委員會批準，且均已簽署知情同意書。

1.2實驗試劑 人單核細胞系THP-1購自北京協(xié)和細胞資源中心。RPMI1640培養(yǎng)液和胎牛血清購自英國Abcam公司。佛波酯(PMA)購自北京百靈威生物科技有限公司。氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)購自北京索萊寶科技有限公司。IL-17、IL-23、IL-1β、IL-6和TNF-α試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。NF-κB P65、IL-1β、IL-6和TNF-α一抗和實驗所用二抗均購自英國Abcam公司。

1.3細胞培養(yǎng) 人單核細胞系THP-1用含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液在5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度為37℃。每2 d換一次培養(yǎng)液，3～4 d傳代一次。細胞計數(shù)后參照文獻〔7〕方法，用含100 ng/ml PMA的培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度，以2.5×104個/ml的濃度接種于96孔板上。培養(yǎng)72 h后，THP-1經(jīng)PMA誘導分化為巨噬細胞，隨機分為兩組，去除含PMA的原培養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗2次，分別加入ox-LDL培養(yǎng)液，對照組加入0 mg/ml的ox-LDL，誘導組加入50 mg/ml的ox-LDL處理，培養(yǎng)24 h后觀測細胞形態(tài)并進行檢測。

1.4酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)檢測炎癥因子的表達 采取受試者外周血5 ml，離心(3 500 r/min，15 min)后取血清，保存于-20℃待測。IL-17、IL-23、IL-1β、IL-6和TNF-α的濃度均使用ELISA試劑盒檢測，嚴格按照試劑盒說明書操作。

ox-LDL培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后，收集對照組與誘導組的細胞培養(yǎng)液，1 000 r/min離心5 min，收集上清液，根據(jù)ELISA試劑盒說明書檢測IL-23、IL-17的濃度。

1.5Western印跡檢測蛋白表達 ox-LDL培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后，吸取培養(yǎng)液用PBS洗滌2次，用RIPA裂解液進行裂解處理，置于冰上每10 min震蕩一次，共4次，用BCA法進行蛋白定量。蛋白調(diào)至相同濃度后加入5×蛋白上樣緩沖液，95℃變性5 min，以1 500 r/min低速離心后以待上樣。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)后轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%脫脂奶室溫封閉2 h，分別加入NF-κB P65一抗(兔抗人IgG)溶液(1∶1 000)、IL-1β一抗(兔抗人IgG)溶液(1∶500)、IL-6一抗(兔抗人IgG)溶液(1∶1 000)和IL-6一抗(兔抗人IgG)溶液(1∶500)于4℃孵育過夜。第二天用Tris-HCl緩沖鹽溶液加吐溫20(TBST)洗滌3次，每次5 min。加入二抗，室溫孵育2 h，TBST緩沖液洗滌5次，每次8 min?？贵w封閉洗脫完畢后，對PVDF膜進行顯影。使用FCE型凝膠化學發(fā)光成像儀拍照，Image J軟件進行灰度分析。

1.6統(tǒng)計學方法 采用SPSS19.0軟件行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1炎癥因子濃度在血清中的變化 穩(wěn)定性心絞痛組和不穩(wěn)定性心絞痛組血清中IL-23與IL-17濃度均明顯高于對照組，且不穩(wěn)定性心絞痛組IL-23與IL-17濃度最高(P<0.01，P<0.001)。同時，與對照組比較，穩(wěn)定性心絞痛組和不穩(wěn)定性心絞痛組血清IL-1β、IL-6和TNF-α濃度均明顯升高(P<0.01，P<0.001)，且不穩(wěn)定性心絞痛組IL-1β、IL-6、TNF-α濃度高于穩(wěn)定性心絞痛組(P<0.05)。見表1，表2。

2.2IL-17和IL-23在泡沫細胞中的表達 對照組細胞為THP-1細胞分化的巨噬細胞，呈圓形或橢圓形貼壁生長；誘導組細胞，經(jīng)油紅O染色，顯微鏡下可見細胞質(zhì)內(nèi)有大量紅色脂質(zhì)顆粒沉積，符合泡沫細胞的形態(tài)學特征，見圖1。與對照組相比，誘導組中IL-17與IL-23濃度顯著升高(P<0.01，表3)。

表1 3組血清IL-17和IL-23濃度比較

與對照組比較：1)P<0.01，2)P<0.001

表2 3組血清IL-1β、IL-6和TNF-α濃度比較

與對照組比較：1)P<0.01,2)P<0.001；與穩(wěn)定性心絞痛組比較：3)P<0.05，下表同

圖1 ox-LDL誘導的THP-1細胞形態(tài)變化(油紅O染色，×200)

組別IL-17IL-23對照組412.0±54.2345±41.3誘導組734±67.11)687±87.51)

2.3NF-κB P65、IL-1β、IL-6和TNF-α在泡沫細胞中的表達 誘導組THP-1細胞NF-κB P65、IL-1β、IL-6和TNF-α表達均明顯高于對照組(P<0.01，圖2，表4)，表明NF-κB P65信號通路參與了CHD患者炎癥反應(yīng)的調(diào)控。

圖2 Western印跡檢測細胞中NF-κB P65、IL-1β、IL-6和TNF-α的表達

組別NF-κB P65 IL-1βIL-6TNF-α對照組0.12±0.040.10±0.020.20±0.020.11±0.05誘導組0.84±0.061)0.92±0.071)0.95±0.081)0.89±0.071)

3 討 論

CHD是一種AS引起的慢性炎癥性疾病，其發(fā)病機制與動脈脂代謝紊亂、遺傳因素和免疫反應(yīng)異常有關(guān)，發(fā)病過程中巨噬細胞可分化形成泡沫細胞，從而分泌出大量炎癥介質(zhì)誘導炎癥反應(yīng)的發(fā)生〔8～10〕。大量研究表明，炎癥系統(tǒng)異常與CHD患者預后密切相關(guān)，是導致CHD患者心絞痛不穩(wěn)定的主要因素〔11〕。IL-23/IL-17炎癥軸在CHD等炎癥性疾病的發(fā)病過程中起關(guān)鍵作用，可通過激活巨噬細胞進而誘導中性粒細胞聚集加重病情并產(chǎn)生不良預后〔12〕。因此，探究IL-23/IL-17在CHD中的作用及作用機制可能有利于尋找CHD治療的潛力藥物。本實驗結(jié)果表明，IL-23/IL-17炎癥軸的激活引起了相應(yīng)炎癥因子濃度升高，并可能導致CHD患者不穩(wěn)定性心絞痛。

巨噬細胞是血管炎癥的中心載體，在AS的發(fā)病機制中扮演重要角色〔13〕。細胞ox-LDL水平與CHD患者體內(nèi)M1巨噬細胞的分化有直接關(guān)系，ox-LDL可誘導巨噬細胞分化為泡沫細胞，從而誘導炎癥因子的產(chǎn)生，誘發(fā)AS〔14〕。本實驗用PMA誘導THP-1細胞系分化后與ox-LDL共同孵育，誘導泡沫細胞形成，經(jīng)形態(tài)學觀察表明細胞模型構(gòu)建成功。進一步研究發(fā)現(xiàn)，泡沫細胞IL-23和IL-17的濃度與正常巨噬細胞比較明顯升高，同時，泡沫細胞中NF-κB P65、IL-1β、IL-6和TNF-α蛋白呈高表達狀態(tài)，進一步表明IL-23/IL-17炎癥軸參與了CHD及AS的發(fā)生發(fā)展。

研究表明，NF-κB 信號通路的激活是冠狀動脈微栓塞炎癥反應(yīng)的主要發(fā)病機制〔15〕。通過上游因子的活化可促使NF-κB激活，進一步促進TNF-α及其他促炎因子的釋放，最終影響冠狀動脈微栓塞引發(fā)的心臟功能障礙的發(fā)生和發(fā)展〔16〕。IL-23在脂多糖(LPS)的刺激或異常的炎癥條件下，可使NF-κB信號通路激活，刺激CD4+T細胞分化為Th17，使Th17分泌促炎癥因子IL-1、IL-6、IL-17、IL-22和TNF-α，表明NF-κB信號通路參與IL-23/IL-17炎癥軸的活化，進一步引起炎癥反應(yīng)〔17,18〕。同時，NF-κB信號通路與IL-23/IL-17炎癥軸的共同作用使IL-1β與TNF-α在巨噬泡沫細胞中聚集并發(fā)生炎癥反應(yīng)，提示二者共同作用參與了CHD及相關(guān)疾病的病程發(fā)展〔19〕。本文研究結(jié)果提示IL-23/IL-17炎癥軸誘導CHD患者炎癥反應(yīng)可能與激活NF-κB炎癥信號通路有關(guān)。

綜上所述，IL-23/IL-17炎癥軸的活化與CHD患者的炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，可能是導致不穩(wěn)定性心絞痛的原因，并且作用機制可能與NF-κB信號通路的激活有關(guān)。