劉增亮，汪 茜，宋 娟，周雙云，覃曉娟，車江旅，陳廷速*

(1.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物研究所，廣西 南寧 530007；2.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所，廣西 南寧 530007；3.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，廣西 南寧 530007)

【研究意義】生姜(ZingiberofficinaleRosc.)屬多年生草本植物，在亞洲地區(qū)多被用作傳統(tǒng)藥物[1]，也是世界范圍內(nèi)廣泛應(yīng)用的主要香辛類保健蔬菜[2]。我國(guó)生姜栽培歷史久遠(yuǎn)，2018年栽培面積達(dá)29.9萬(wàn)hm2[3]，在食品、醫(yī)藥和化妝品等多個(gè)行業(yè)均有應(yīng)用[4]。隨著生姜種植面積的不斷擴(kuò)大和種植規(guī)模化，姜瘟病、莖腐病和斑點(diǎn)病等病害也日益嚴(yán)重，經(jīng)濟(jì)損失巨大。目前對(duì)這些病害的防治以化學(xué)農(nóng)藥防治為主，大量使用化學(xué)藥劑導(dǎo)致環(huán)境污染和抗藥性增加，也危害人體健康。內(nèi)生真菌特別是內(nèi)生木霉菌是植物病害生防微生物的重要來(lái)源[5]，其抑菌機(jī)制多樣，生防潛力巨大。因此，探究生姜內(nèi)生木霉菌株的生態(tài)學(xué)特性，對(duì)該菌株的發(fā)酵生產(chǎn)、制劑研制及田間應(yīng)用于姜瘟病、莖腐病和斑點(diǎn)病等病害防治具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】?jī)?nèi)生木霉菌廣泛分布于可可[6]、茶樹(shù)[7]、香蕉[8]、蘆薈[9]、蘆竹[10]、銀杏[11]、紅豆杉[12]、板藍(lán)根[13]、枸骨[14]、滇牡丹[15]、香榧[16]、楊樹(shù)[17]和枇杷[18]等植物根際。王莉衡等[9]研究顯示，庫(kù)拉索蘆薈內(nèi)生哈茨木霉LH-7對(duì)9種常見(jiàn)植物病原真菌具有顯著的抑制作用(抑制率為62.4 %～88.4 %)，該菌株的代謝產(chǎn)物含有抑制病原菌生長(zhǎng)及孢子萌發(fā)的活性物質(zhì)，可導(dǎo)致病原菌菌絲體生長(zhǎng)畸形、細(xì)胞壁破裂、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)發(fā)育不健全、孢子形成及萌發(fā)率降低，從而有效抑制病原菌的生長(zhǎng)和繁殖。王國(guó)平等[12]研究顯示，用紅豆杉內(nèi)生木霉菌防治水稻紋枯病，防效達(dá)63.82 %，與50 μg/mL井岡霉素A的防治效果相當(dāng)。楊蕾等[17]從楊樹(shù)內(nèi)生菌中篩選出1株楊樹(shù)潰瘍病拮抗真菌YGF9，其對(duì)楊樹(shù)離體組織潰瘍病防治效果可達(dá)76.47 %，是防治楊樹(shù)潰瘍病的潛在生防菌株，初步鑒定該菌株為黃綠木霉(Trichodermaaureoviride)。魯海菊等[18]測(cè)定分離自黃瓜及枇杷的12株內(nèi)生木霉菌對(duì)枇杷根腐病病菌的抑制效果，結(jié)果表明12株內(nèi)生木霉對(duì)枇杷根腐病病菌均有抑制作用，菌株P(guān)3.9抑菌率最高，達(dá)80.1 %?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，關(guān)于生姜內(nèi)生木霉菌的研究未見(jiàn)報(bào)道；本課題組前期對(duì)生姜內(nèi)生真菌進(jìn)行了分離篩選，得到一株拮抗生姜莖腐病菌和香蕉枯萎病菌的內(nèi)生真菌BJM-11，并將其鑒定為綠色木霉(Trichodermaviride)，菌株BJM-11生防潛力巨大，但對(duì)其生長(zhǎng)和產(chǎn)孢所需溫度、pH、碳源和氮源等影響因子的了解甚少?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】采用菌落生長(zhǎng)法和血球計(jì)數(shù)板孢子計(jì)量法，對(duì)木霉菌株BJM-11進(jìn)行詳細(xì)的生態(tài)學(xué)特性分析，明確其生長(zhǎng)及產(chǎn)孢條件，為該菌株的發(fā)酵生產(chǎn)、制劑研制及田間應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

內(nèi)生真菌BJM-11分離自從廣西百色采集的生姜健康根系，結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法鑒定為綠色木霉(Trichodermaviride)，由廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物研究所土壤微生物研究室分離保存(保藏編號(hào)為CGMCC NO.17196)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 溫度對(duì)菌株BJM-11菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響 將內(nèi)生真菌BJM-11在PDA平板上25 ℃下培養(yǎng)3 d后，從平板邊緣取4 mm菌餅接種于PDA培養(yǎng)基，然后分別于5、10、15、20、25、30、35和40 ℃條件下恒溫培養(yǎng)，保持黑暗，48 h后十字交叉測(cè)量菌株BJM-11的菌落直徑，7 d后鏡檢孢子數(shù)量，每處理5次重復(fù)。

1.2.2 pH對(duì)菌株BJM-11菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響 將PDA培養(yǎng)基的pH分別調(diào)為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0和12.0(PDA培養(yǎng)基在pH低于4.0時(shí)無(wú)法凝固)，將直徑約4.0 mm的BJM-11菌餅接種于上述不同pH的PDA平板中央，25 ℃恒溫培養(yǎng)，保持黑暗，48 h后測(cè)量菌株BJM-11的菌落直徑，7 d后鏡檢孢子數(shù)量，每處理5次重復(fù)。

1.2.3 光照對(duì)內(nèi)生真菌BJM-11菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響 將接種直徑約4.0 mm BJM-11菌餅的PDA平板分別置于光照條件設(shè)定為24 h連續(xù)黑暗、24 h連續(xù)光照和12 h光暗交替(12 h光照+12 h黑暗)的恒溫培養(yǎng)箱中，25 ℃培養(yǎng)，48 h后測(cè)量菌株BJM-11的菌落直徑，7 d后鏡檢孢子數(shù)量，每處理5次重復(fù)。

1.2.4 碳源對(duì)菌株BJM-11菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響 以查氏培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)基，以葡萄糖、木糖、果糖、可溶性淀粉、蔗糖、乳糖、甘露醇和麥芽糖8種供試碳源等量替換(添加量均為3 %)蔗糖配制成含不同碳源的培養(yǎng)基，將直徑約4.0 mm的BJM-11菌餅接種于上述碳源培養(yǎng)基中央，每處理5次重復(fù)，25 ℃恒溫培養(yǎng)，保持黑暗，48 h后測(cè)量菌株BJM-11的菌落直徑，7 d后鏡檢孢子數(shù)量，每處理5次重復(fù)。

1.2.5 氮源對(duì)菌株BJM-11菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響 以查氏培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，以鉬酸銨、硝酸銨、亮氨酸、酵母浸粉、尿素、硝酸鉀、胰蛋白胨、甲硫氨酸、脯氨酸、蛋白胨和牛肉膏11種氮源等量替換(添加量均為0.2 %)硝酸鈉配制成含不同氮源的培養(yǎng)基，接種直徑約4.0 mm的BJM-11菌餅，每處理5次重復(fù)，25 ℃恒溫培養(yǎng)，保持黑暗，48 h后測(cè)量菌株BJM-11的菌落直徑，7 d后鏡檢孢子數(shù)量，每處理5次重復(fù)。

1.2.6 不同培養(yǎng)基對(duì)菌株BJM-11菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響 將直徑約4.0 mm的BJM-11菌餅分別接種到PDA、馬鈴薯蔗糖瓊脂(PSA)、玉米粉瓊脂(CMA)、查氏和NA 5種培養(yǎng)基上，25 ℃恒溫培養(yǎng)，保持黑暗條件，48 h后測(cè)量菌株BJM-11的菌落直徑，7 d后鏡檢孢子數(shù)量，每處理5次重復(fù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溫度對(duì)菌株BJM-11菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響結(jié)果

從圖1-A可看出，菌株BJM-11在10～35 ℃范圍內(nèi)均可生長(zhǎng)，在20～30 ℃范圍內(nèi)菌絲生長(zhǎng)較好，在25 ℃時(shí)菌絲生長(zhǎng)最好，在10和35 ℃條件下菌絲生長(zhǎng)緩慢，在5和40 ℃時(shí)幾乎無(wú)法生長(zhǎng)。其中，菌株BJM-11在25和30 ℃時(shí)的菌落直徑較大，二者差異不顯著(P>0.05，下同)，但均顯著大于其他溫度處理(P<0.05，下同)。從圖1-B可看出，菌株BJM-11在10～35 ℃溫度范圍內(nèi)均能產(chǎn)孢，適合產(chǎn)孢的溫度范圍為20～30 ℃，在5和40 ℃時(shí)幾乎無(wú)法產(chǎn)孢。其中，在溫度為25 ℃時(shí)產(chǎn)孢量最大，且顯著大于其他溫度處理，在溫度為30和20 ℃時(shí)次之，二者差異不顯著，但均顯著大于其他溫度處理。

綜上所述，25和30 ℃較適宜菌株BJM-11菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢。

2.2 不同pH對(duì)菌株BJM-11菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響結(jié)果

從圖2-A可看出，菌株BJM-11在pH 4.0～12.0范圍內(nèi)均可生長(zhǎng)，在pH 4.0～10.0范圍內(nèi)菌絲生長(zhǎng)較好。其中pH為5.0和6.0時(shí)的菌落直徑較大，二者差異不顯著，但均顯著大于其他pH處理；從圖2-B可看出，菌株BJM-11在pH 4.0～12.0范圍內(nèi)均可產(chǎn)孢，pH 4.0～10.0范圍內(nèi)產(chǎn)孢量效果較佳。其中菌株BJM-11在pH為5.0、6.0和7.0時(shí)的產(chǎn)孢量較大，三者差異不顯著，但均顯著大于其他pH處理。

綜上所述，pH為5.0和6.0時(shí)較適宜菌株BJM-11菌絲生長(zhǎng)，pH為5.0、6.0和7.0時(shí)較適宜菌株BJM-11產(chǎn)孢。

2.3 不同光照條件對(duì)菌株BJM-11菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響結(jié)果

從圖3-A可看出，菌株BJM-11在24 h連續(xù)光照、24 h連續(xù)黑暗和12 h光暗交替條件下均可生長(zhǎng)。其中24 h連續(xù)黑暗處理的菌落直徑最大，且顯著大于其他光照處理。從圖3-B可看出，菌株BJM-11在24 h連續(xù)光照、24 h連續(xù)黑暗和12 h光暗交替條件下均可產(chǎn)孢。其中在24 h連續(xù)光照條件下產(chǎn)孢量最大，且顯著大于其他光照處理。

綜上所述，24 h連續(xù)黑暗較適宜菌株BJM-11菌絲生長(zhǎng)，24 h連續(xù)光照較適宜菌株BJM-11產(chǎn)孢。

圖柱上不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。圖2～6同Different lowercase letters on the bar represented significant difference(P<0.05). The same was applied in Fig.2-6圖1 不同溫度對(duì)菌株BJM-11菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響Fig.1 Effects of different temperature on mycelium growth and sporulation of strain BJM-11

圖2 不同pH對(duì)菌株BJM-11菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響Fig.2 Effects of different pH on mycelium growth and sporulation of strain BJM-11

圖3 不同光照對(duì)菌株BJM-11菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響Fig.3 Effects of different light on mycelium growth and sporulation of strain BJM-11

2.4 不同碳源對(duì)菌株BJM-11菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響結(jié)果

從圖4-A可看出，菌株BJM-11在供試的8種碳源培養(yǎng)基上均能生長(zhǎng)，在碳源為葡萄糖、果糖、可溶性淀粉、蔗糖、乳糖、甘露醇和麥芽糖時(shí)菌絲生長(zhǎng)較好，在碳源為木糖時(shí)菌絲生長(zhǎng)緩慢。其中碳源為葡萄糖和可溶性淀粉時(shí)菌落直徑較大，二者差異不顯著，但碳源為葡萄糖處理的菌落直徑顯著大于其他碳源處理；從圖4-B可看出，菌株BJM-11在供試的8種碳源培養(yǎng)基上均能產(chǎn)孢，適合產(chǎn)孢的碳源為葡萄糖、果糖、可溶性淀粉、蔗糖、乳糖、甘露醇和麥芽糖。其中碳源為甘露醇時(shí)，菌株BJM-11的產(chǎn)孢量最大，且顯著大于其他碳源處理。

綜上所述，以葡萄糖或可溶性淀粉為碳源較適宜菌株BJM-11菌絲生長(zhǎng)，以甘露醇為碳源較適宜菌株BJM-11產(chǎn)孢。

圖4 不同碳源對(duì)菌株BJM-11菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響Fig.4 Effects of different carbon sources on mycelium growth and sporulation of strain BJM-11

圖5 不同氮源對(duì)菌株BJM-11菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響Fig.5 Effects of different nitrogen sources on mycelium growth and sporulation of strain BJM-11

2.5 不同氮源對(duì)菌株BJM-11菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響結(jié)果

從圖5-A可看出，菌株BJM-11在供試的11種氮源培養(yǎng)基上均能生長(zhǎng)，在氮源為鉬酸銨、硝酸銨、亮氨酸、酵母浸粉、硝酸鉀、胰蛋白胨、甲硫氨酸、脯氨酸、蛋白胨和牛肉膏時(shí)菌絲生長(zhǎng)較好，在氮源為尿素時(shí)菌絲生長(zhǎng)緩慢。其中氮源為酵母浸粉和蛋白胨時(shí)，菌株BJM-11的菌落直徑較大，二者差異不顯著，但均顯著大于其他氮源處理。從圖5-B可看出，菌株BJM-11在供試的11種氮源培養(yǎng)基上均能產(chǎn)孢，適合產(chǎn)孢的氮源為鉬酸銨、硝酸銨、亮氨酸、酵母浸粉、硝酸鉀、胰蛋白胨、脯氨酸、蛋白胨和牛肉膏，不適合產(chǎn)孢的氮源為尿素和甲硫氨酸。其中氮源為蛋白胨時(shí)，菌株BJM-11的產(chǎn)孢量最大，且顯著大于其他氮源處理。

綜上所述，以酵母浸粉或蛋白胨為氮源較適宜菌株BJM-11菌絲生長(zhǎng)，以蛋白胨為氮源較適宜菌株BJM-11產(chǎn)孢。

2.6 不同培養(yǎng)基對(duì)菌株BJM-11菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響結(jié)果

從圖6-A可看出，菌株BJM-11在PDA、PSA、CMA、查氏和NA 5種培養(yǎng)基上均能生長(zhǎng)。其中培養(yǎng)基為PDA和PSA時(shí)，菌株BJM-11的菌落直徑較大，二者差異不顯著，但均顯著大于其他培養(yǎng)基處理。從圖6-B可看出，菌株BJM-11在PDA、PSA、CMA、查氏和NA 5種培養(yǎng)基上均能產(chǎn)孢。其中培養(yǎng)基為PDA時(shí)，菌株BJM-11的產(chǎn)孢量最大，且顯著大于其他培養(yǎng)基處理。

綜上所述，以PDA或PSA為培養(yǎng)基較適宜菌株BJM-11菌絲生長(zhǎng)，以PDA為培養(yǎng)基較適宜菌株BJM-11產(chǎn)孢。

3 討 論

內(nèi)生真菌是定殖于宿主植物組織、但不引起宿主植物產(chǎn)生明顯病變的一類真菌[18]，其在植物體內(nèi)生長(zhǎng)定殖是共同進(jìn)化選擇的結(jié)果，在進(jìn)化過(guò)程中二者形成了互惠共生關(guān)系，使內(nèi)生真菌產(chǎn)生與植物相同或相似的次級(jí)代謝產(chǎn)物[18-19]。這些次級(jí)代謝產(chǎn)物主要是抗生素類和水解酶類物質(zhì)，能促進(jìn)作物生長(zhǎng)并抑制病原菌生長(zhǎng)[20]。自Stierle等[21]從藥用植物紅豆杉韌皮部分離到1株能產(chǎn)紫杉醇的內(nèi)生真菌后，學(xué)者們才探索將內(nèi)生真菌尤其是藥用植物內(nèi)生真菌作為新型藥用活性成分的重要潛在原料[22]，此后對(duì)藥用真菌內(nèi)生真菌的研究應(yīng)用迅速成為熱點(diǎn)，但針對(duì)生姜內(nèi)生真菌的相關(guān)研究?jī)H見(jiàn)Anisha等[23-25]從生姜中分離篩選到3株對(duì)生姜莖腐病菌具有明顯拮抗活性內(nèi)生真菌Rhizopycnisvagum、Paraconiothyriumsp.和Acremoniumsp.及Ginting等[26]從生姜中分離篩選到3株對(duì)尖孢鐮刀菌Fusariumoxysporum并分別鑒定為Curvulariaaffinis、Fusariumsolani和Glomerellacingulata的報(bào)道。

木霉菌是防治作物土傳病害的重要拮抗真菌，種類繁多，不同種及同種不同菌株在生態(tài)學(xué)特性等方面存在明顯差異[27-30]。本研究中，菌株BJM-11喜偏酸環(huán)境條件，在25～30 ℃及光照條件下其菌絲生長(zhǎng)量和產(chǎn)孢量均較大，與劉連妹[31]、紀(jì)明山[32]對(duì)綠色木霉菌株的研究結(jié)果相似。本研究發(fā)現(xiàn)，菌株BJM-11的生態(tài)學(xué)特性也與其他報(bào)道[31-32]存在差異，如對(duì)溫度的適應(yīng)范圍較窄，35 ℃時(shí)菌絲生長(zhǎng)緩慢且完全不能產(chǎn)孢，可能與其宿主生姜生長(zhǎng)喜陰涼不耐高溫有關(guān)。在利用碳源方面，菌株BJM-11在碳源為葡萄糖時(shí)的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)較佳，與綠色木霉HT-01[31]和TR-8[32]的特性相似，但菌株BJM-11以甘露醇為碳源時(shí)產(chǎn)孢量最大，與綠色木霉HT-01[31]和TR-8[32]產(chǎn)孢的最佳碳源為葡萄糖不一致。在氮源利用方面，菌株BJM-11在氮源為蛋白胨時(shí)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和產(chǎn)孢狀況較好，其次為亮氨酸，與綠色木霉TR-8[32]營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的最適氮源為天門冬酰胺、亮氨酸不利于產(chǎn)孢的特性不一致；尿素不利于菌株BJM-11生長(zhǎng)和產(chǎn)孢，與綠色木霉TR-8[32]對(duì)氮源利用特性一致。綜合分析認(rèn)為，在發(fā)酵培養(yǎng)基中碳源為葡萄糖或可溶性淀粉、氮源為酵母浸粉或蛋白胨時(shí)菌株BJM-11菌絲生長(zhǎng)速度較快，在碳源為甘露醇、氮源為蛋白胨時(shí)菌株BJM-11產(chǎn)孢量較大，可用于指導(dǎo)其發(fā)酵生產(chǎn)。

目前關(guān)于菌株BJM-11對(duì)生姜的促生作用及相互作用的機(jī)理還不清楚，有待深入探究。

4 結(jié) 論

菌株BJM-11在溫度25～30 ℃、pH 5.0～6.0、連續(xù)黑暗及以葡萄糖或可溶性淀粉為碳源、以蛋白胨或酵母浸粉為氮源、培養(yǎng)基為PDA或PSA條件下菌絲生長(zhǎng)狀況較佳，在溫度25～30 ℃、pH 5.0～7.0、連續(xù)光照及以甘露醇為碳源、以蛋白胨為氮源、培養(yǎng)基為PDA條件下產(chǎn)孢量較大，可供開(kāi)發(fā)利用BJM-11菌株參考。