魏環(huán)宇，童文杰，藺忠龍，莫笑晗，張麗芳,6，何元勝，鄭元仙，王繼明，許銀蓮，陳小龍，鐘 宇，余 磊，鄧小鵬*

(1.昆明學院/云南省都市特色農(nóng)業(yè)工程技術研究中心，云南 昆明 650214；2.云南省煙草農(nóng)業(yè)科學研究院，云南 昆明 650201；3.中國煙草總公司云南省公司，云南 昆明 650011；4.云南省煙草公司臨滄市公司，云南 臨滄 677000；5.河南中煙工業(yè)有限責任公司原料采購中心，河南 鄭州 450000；6.曲靖師范學院生物資源與食品工程學院，云南 曲靖 655011)

【研究意義】煙草(NicotianatabacumL.)是中國重要的經(jīng)濟作物之一，而煙草病害的發(fā)生嚴重影響煙葉產(chǎn)量和品質(zhì)，國內(nèi)外不同生產(chǎn)時期的煙草栽培及品種選育，均把抗病性及抗病機制作為重要的目標進行研究[1-3]。隨著現(xiàn)代科學技術的發(fā)展及煙草相關研究的深入，煙草病害抗性遺傳資源、主要病害抗性基因的篩選和發(fā)掘利用受到越來越廣泛的關注。目前采用圖位克隆、轉(zhuǎn)座子標簽和同源序列擴增等技術已經(jīng)從多種植物中分離出了70多種抗病基因，如亞麻、擬南芥、水稻、甜菜、番茄、等作物中的抗病基因，它們在激活抗病防衛(wèi)系統(tǒng)中有很重要的作用[5-7]。其中NBS-LRR類抗病基因家族廣泛存于真核生物中，是非常重要且所含基因數(shù)目最多的一類抗病基因。研究表明，NBS-LRR抗病基因主要包括Tir/CC、NBS和LRR三大結(jié)構(gòu)域，其中NBS保守結(jié)構(gòu)域可進一步分為P-loop、MHDV等8個保守基序[8-9]?？共』蛲葱蛄?resistance gene analog，RGA)克隆法基于已知植物抗病基因的NBS保守結(jié)構(gòu)域設計簡并引物，通過擴增并分析獲得抗病基因同源序列，以鑒定候選基因，是克隆抗病基因最快和最有效的方法[4]?！厩叭搜芯窟M展】Tian等(2004)利用NBS-LRR抗病基因設計并合成簡并引物從甜菜基因組中克隆出12個NBS-LRR類抗病基因同源序列[10]。丁國華等(2005)利用NBS保守結(jié)構(gòu)域設計簡并引物從黃瓜中擴增得到10條具有開放閱讀框的抗病基因同源序列[11]。有關煙草RGAs的研究，國內(nèi)外尚未見報道?！颈狙芯壳腥朦c】本研究根據(jù)已報道的植物抗病基因NBS-LRR類保守結(jié)構(gòu)域，篩選并合成簡并引物，對云南主栽烤煙品種紅花大金元進行抗病基因同源克隆，并對其RGAs進行結(jié)構(gòu)和序列比對分析。【擬解決的關鍵問題】以紅花大金元烤煙品種抗病基因同源序列為參照，對云煙87、K326等烤煙品種相關基因進行比較分析，為進一步培育抗病新品種及定向分子育種研究提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試煙草品種為紅花大金元常規(guī)栽培品種，用于RGAs克隆的DNA提取所用煙葉樣品來自云南省煙草農(nóng)業(yè)科學研究院農(nóng)藝中心。

1.2 試驗方法

1.2.1 煙草DNA的提取 煙草葉片總DNA的提?。禾崛煵萑~片基因組總DNA，采用修改Allen (2006)的CTAB法操作步驟[12]，將提出的煙草總DNA經(jīng)1 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.2 簡并引物的篩選與合成 根據(jù)已報道的水稻、亞麻、番茄、馬鈴薯、煙草、擬南芥等NBS-LRR類抗病基因NBS保守結(jié)構(gòu)域(P-loop、GLPL)篩選、合成PCR簡并引物。擴增引物見表1。

1.2.3 煙草RGAs序列的PCR擴增 將上述簡并引物用于PCR擴增。其中25 μl反應體系中含有10×PCR buffer (plus Mg2+) 2.5 μl，dNTPs (2.5 mmol/L) 0.5 μl，F(xiàn)orward primer (10μmol/L) 2.5 μl，Reverse primer (10 μmol/L) 2.5 μl，Taq(5 U/μl) 0.2 μl，DNA模板1 μl ，dd H2O 15.8 μl。反應條件為94 ℃預變性3 min；94 ℃ 變性45 s，50 ℃ 退火45 s，72 ℃ 延伸1 min，共42個循環(huán)；72 ℃ 延伸8 min。

1.2.4 PCR產(chǎn)物的回收與克隆 PCR擴增產(chǎn)物用1.5 %瓊脂糖凝膠檢測后，參考已知作物NBS類抗病基因片段大小的目的條帶，按照TRANS膠回收試劑盒說明書進行回收。將回收片段連接到pMD18-T載體上，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中，挑取陽性單菌落送公司測序。

1.2.5 序列分析 使用DNAMAN軟件將測序獲得的片段載體序列去除，然后翻譯成氨基酸序列，再使用NCBI進行同源性比對分析。進一步用DNAMAN對已知功能的基因及課題組前期研究所獲得的RGAs的基因進行多序列比對，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。用于參比的R基因有擬南芥RPM1 (X87851)、煙草N(AAA50763)、亞麻L6(AAA91022)、番茄Mi(AAC9x7933)、番茄PRF(U65391)及水稻Xa-1(BAA25068)，其中煙草N和亞麻L6基因為TIR-NBS-LRR類，其余基因為non-TIR-NBS-LRR類。用于參比的煙草RGAs為TRGA87-1(MK624312)、TRGA87-2(MK624313)、TRGA87-3(MK624314)、TRGA87-4(MK624315)、TRGAK-1(MK624316)、TRGAK-2(MK624317)、TRGAK-4(MK624318)、TRGAK-4(MK624319)。

表1 用于PCR擴增的簡并引物

2 結(jié)果與分析

2.1 煙草RGAs的擴增、克隆及序列測定

參考已知植物相關NBS類抗病基因篩選出3對簡并引物(表1)，對煙草DNA進行PCR擴增，經(jīng)回收、克隆，進行菌落PCR篩選后測序，獲得6條與已知抗病基因具有高度同源性的NBS-LRR類煙草抗病基因同源序列(Tobacco Resistance Gene Analogs，TRGA)，目的片段大小均在500 bp左右(圖1)，與預期擴增片段大小一致。進一步分析后發(fā)現(xiàn)6條煙草RGAs中，有4個具有連續(xù)的開放閱讀框(ORFs)和NBS功能結(jié)構(gòu)域。將其提交到NCBI數(shù)據(jù)庫，GenBank登錄號分別為MN027515、MN027516、MN027517、MN027518。上述結(jié)果表明，利用簡并引物進行同源擴增是分離煙草RGAs的有效方法。

2.2 煙草RGAs與已知R基因的同源性分析

將測序結(jié)果去除載體序列和重復基因后，通過 Blastx 進行同源性比對分析。結(jié)果表明，煙草RGAs與已知的多種植物的R基因具有較高的氨基酸同源性，比對分析與其他已報道植物NBS-LRR同源性高達64 %～98 %(表2)。

上圖：引物1F，1R; 下圖：引物2F，2R; 方框：PCR擴增的煙草NBS-LRR同源序列, 片段大小約500 bp左右；DL2000：DNAMarkerThe above figure : Primer 1F,1R; The following figure: Primer 2F,2R; The box: NBS-LRR homology sequence of PCR amplification tobacco, the fragment size was about 500 bp; DL2000: DNA Marker圖1 簡并引物用于煙草TRGAHs的擴增結(jié)果Fig.1 Degenerate primers for amplification results of tobacco TRGAHs

2.3 煙草RGAs保守結(jié)構(gòu)域分析

利用DNAMAN將獲得的4條煙草RGAs序列進行多重序列比對分析(圖2，封三) 。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，4條序列均具有NBS類R基因區(qū)域典型的幾個保守基序，即P-loop(GMGGVGGKTT)、Kinase-2(LIVLDDVW)模體和GLPLAL疏水性區(qū)段，而在Kinase-2(LIVLDDVD/W)區(qū)的最后一個氨基酸為天冬氨酸(W)或色氨酸(D)，推測所擴增的煙草紅花大金元中的4條RGAs序列，既存在non-TIR-NBS-LRR (CC-NBS-LRR)類型，也存在TIR-NBS-LRR類型[15]。

2.4 煙草RGAs氨基酸序列聚類分析

應用DNAMAN將擴增出的4條RGAs氨基酸序列與已知植物抗病基因：擬南芥RPM1 (X87851)，煙草N(AAA50763)，亞麻L6(AAA91022)，番茄Mi(AAC9x7933)，番茄PRF(U65391)及水稻Xa-1 (BAA25068)；及前期研究獲得的云煙87和煙草K326中獲得的8條抗病基因同源序列進行聚類分析(圖3)。結(jié)果顯示，所得到的4條煙草紅花大金元RGAs與已知植物的R基因相似性在29 %～52 %。其中TRGAH-1與擬南芥RPM1相似性為29 %；TRGAH-2和TRGAH-4與番茄Mi和番茄PRF相似性為50 %，并且上述聚類已知植物抗病基因同源序列均為non-TIR-NBS-LRR類R基因；另外，TRGAH-3與煙草N和亞麻L6的相似性分別為43 %和38 %，且與亞麻L6和煙草N聚為一大類，表明TRGAH-3序列均為TIR-NBS-LRR類，與前面氨基酸多重序列比較結(jié)果相一致。顯示煙草紅花大金元中的RGAs具有NBS抗病基因的non-TIR-NBS-LRR和TIR-NBS-LRR兩大類。

此外，這4條煙草紅花大金元RGAs與從云煙87、K326中擴增得到的RGAs基因具有不同程度的高度同源性。其中TRGAH-1與TRGA87-1相似性為100 %，TRGAH-2與TRGA87-4、TRGAH-4與TRGA87-3和TRGAK-3的相似性為99 %，TRGAH-3與TRGA87-2、TRGAK-1、TRGAK-2的相似性為43 %。表明煙草不同品種中包含具有NBS結(jié)構(gòu)抗病功能的相同基因，同時也存在不同NBS結(jié)構(gòu)的抗病基因同源序列。

3 討 論

本試驗所采用簡并引物擴增、克隆和分析煙草抗病基因同源序列具有操作簡單、擴增模板用量少、統(tǒng)計效率強、可在復雜基因組植物中應用等特點，因此運用同源序列克隆是一種便捷、經(jīng)濟的分離煙草抗病基因同源序列的方法。目前已從甘薯、番茄、葡萄、芒果等植物中克隆得到了眾多NBS-LRR類RGAs[16-19]，為相關抗病基因的克隆打下基礎，具有良好的應用前景。文中所擴增得到的TRGAH-2和TRGAH-4兩條基因經(jīng)過氨基酸比對，均為煙草抗晚疫病R1A蛋白基因，相似度達96 %以上，表明這2條基因為抗晚疫病R1A蛋白基因；TRGAH-3經(jīng)過氨基酸比對，為與TMV相關的抗病基因；TRGAH-1與抗病RXW24L蛋白相關的基因的相似性為98.89 %，其RXW2L抗病蛋白功能未見報道，TRGAH-1還與擬南芥RPM1基因單獨聚成一類，擬南芥RPM1基因為抗丁香假單胞菌(Pseudomonasspp.)基因，丁香假單胞菌可引起植物細菌性葉斑病，推測TRGAH-1可能在一定程度上對于細菌性葉斑病具有抗性[20]。此外，這4條煙草紅花大金元RGAs與從云煙87、K326中擴增得到的RGAs基因具有不同程度的相似性。顯示煙草不同品種中既包含相同的NBS結(jié)構(gòu)抗病基因同源序列，同時也存在不同NBS結(jié)構(gòu)的抗病基因同源序列。

圖3 煙草RGAs氨基酸序列聚類分析結(jié)果Fig.3 Results of amino acid sequence clustering analysis of tobacco RGAs

由于NBS-LRR類基因家族成員眾多，至今仍未有報道對煙草NBS-LRR類基因進行系統(tǒng)的研究與分析。本研究初步對比和分析了不同煙草品種中的NBS家族RGAs，為下一步研究煙草NBS家族抗病基因奠定基礎。同時對煙草NBS-LRR類抗病基因同源序列的類型、功能等問題的仍有待于進一步深入研究。

4 結(jié) 論

采用抗病基因同源序列克隆法獲獲得煙草NBS-LRR類抗病基因同源序列，表明該方法分離煙草植物抗病基因是可行性的，為進一步篩選和構(gòu)建煙草抗病候選基因，并深入研究其抗病分子機制提供理論基礎。