蔣德旗 柒善懷 張?zhí)m熙 趙仕花 盧燕燕

摘要：目的? 研究復(fù)合酶提取金果欖多糖的最佳條件，并探討其體外抗氧化活性。方法? 復(fù)合酶種類及配比為纖維素酶∶果膠酶∶木瓜蛋白酶=1∶1∶1，液料比固定為20 mL/g，以金果欖多糖得率為響應(yīng)值，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以酶解pH值、酶解時(shí)間、復(fù)合酶添加量、酶解溫度為自變量，采用響應(yīng)面法建立數(shù)學(xué)模型，篩選最佳提取工藝;采用DPPH自由基、羥自由基（·OH）、超氧陰離子自由基（O2-·）清除能力體系評(píng)價(jià)金果欖多糖體外抗氧化活性。結(jié)果? 金果欖多糖最佳提取條件為：酶解pH值5.1，酶解時(shí)間56 min，復(fù)合酶添加量2.0%，酶解溫度52 ℃。在此條件下多糖得率為14.03%，與理論值14.12%的相對(duì)誤差<5%。酶解溫度對(duì)多糖得率影響最顯著，酶解時(shí)間、酶解pH值次之，酶添加量影響最小。金果欖多糖對(duì)DPPH、·OH、O2-·清除的半數(shù)抑制濃度分別為1.358、0.927、1.096 mg/mL，與維生素C比較，抗氧化活性較弱。結(jié)論? 本研究?jī)?yōu)選的金果欖多糖復(fù)合酶法提取工藝方便可行，酶解得到的多糖具有較強(qiáng)的體外抗氧化活性。

關(guān)鍵詞：金果欖;多糖;響應(yīng)面法;復(fù)合酶;抗氧化活性

中圖分類號(hào)：R284.2;R285.5? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? ? 文章編號(hào)：1005-5304（2019）04-0085-06

金果欖為防己科植物青牛膽或金果欖的干燥塊根，主要分布于我國(guó)廣西、四川、貴州等西南地區(qū)。金果欖主要含有季銨生物堿、萜類、甾醇類及多糖等化學(xué)成分[1-2]，性寒味苦，具有清熱解毒、清喉利咽、消腫止痛功效，臨床主要用于治療急慢性咽喉炎、扁桃體炎、菌痢、癰腫疔癤等[3-4]，有“壯藥中的廣譜抗菌素”之稱[5]。目前對(duì)其萜類及生物堿成分的藥理作用研究較多，而對(duì)金果欖多糖的相關(guān)研究鮮見(jiàn)報(bào)道?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，天然產(chǎn)物多糖具有抗炎、抗氧化、抗衰老、降低血糖及增強(qiáng)免疫等多種藥理作用[6-8]，且生物活性強(qiáng)、毒副作用少[9]。本研究采用響應(yīng)面法優(yōu)化復(fù)合酶提取金果欖多糖的工藝條件，并探討其體外抗氧化活性，為金果欖多糖成分進(jìn)一步開(kāi)發(fā)為藥品及食品抗氧化添加劑提供一定的依據(jù)。

1? 儀器與試藥

5810R型高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf;Alpha-1506型紫外分光光度計(jì)，上海譜元儀器有限公司;SHA-BA雙功能水浴恒溫振蕩器，常州華普達(dá)教學(xué)儀器有限公司;PHS-25型pH計(jì)，上海雷磁;SHB-III型循環(huán)水真空泵、2L-ARE旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海皓莊儀器有限公司。

金果欖購(gòu)自廣西玉林眾康大藥房，經(jīng)玉林師范學(xué)院生物與制藥學(xué)院陳曉白教授鑒定為防己科植物金果欖Tinospora capillipes Gagnep.的干燥塊根;維生素C（批號(hào)100425-201709），中國(guó)食品藥品檢定研究院;D-無(wú)水葡萄糖（批號(hào)20171104）、超氧陰離子自由基（O2-·）和羥自由基（·OH）清除能力檢測(cè)試劑盒（批號(hào)20180105），北京索萊寶科技有限公司;纖維素酶（5萬(wàn)U/g，批號(hào)20171205）、果膠酶（10萬(wàn)U/g，批號(hào)20171108）、木瓜蛋白酶（8萬(wàn)U/g，批號(hào)20171013），江蘇銳陽(yáng)生物技術(shù)公司;DPPH（批號(hào)D4313-6HOG4），日本TCI公司;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

2? 方法與結(jié)果

2.1? 提取方法

多糖提取方法參照文獻(xiàn)[10]進(jìn)行，主要包括粉碎過(guò)篩（100目）、特定酶解條件下提取、高溫滅活、分離濃縮、乙醇沉淀、Sevage法脫蛋白、二次醇沉、真空冷凍干燥等系列步驟。

2.2? 多糖含量測(cè)定

采用苯酚-硫酸法測(cè)定多糖含量。以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，490 nm波長(zhǎng)處吸光度值為縱坐標(biāo)，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=8.498 6X-0.018 5，r2=0.990 3，表明葡萄糖的線性范圍為20～120 μg。多糖得率（%）=CnV/m×100%，C為樣品稀釋液中多糖濃度（mg/mL），n為稀釋倍數(shù)，V為樣品稀釋液體積（mL），m為金果欖粉末質(zhì)量（mg）。

2.3? 單因素試驗(yàn)

酶解時(shí)的搖床轉(zhuǎn)速固定為180 r/min，液料比為20 mL/g，復(fù)合酶（纖維素酶-果膠酶-木瓜蛋白酶）配比為1∶1∶1[11]，分別考察酶解pH值、酶解時(shí)長(zhǎng)、酶添加量和酶解溫度對(duì)金果欖多糖得率的影響，其中各因素固定水平為pH值5.0、酶添加量2.0%、酶解時(shí)間60 min、酶解溫度50 ℃。

2.3.1? 復(fù)合酶添加量

復(fù)合酶添加量分別為1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%時(shí)的多糖得率見(jiàn)圖1。當(dāng)復(fù)合酶添加量增加到2.0%時(shí)，多糖得率可達(dá)13.47%，進(jìn)一步加大酶用量，多糖得率無(wú)顯著提升，說(shuō)明在該底物濃度下酶濃度已趨于飽和，繼續(xù)增加復(fù)合酶用量對(duì)多糖得率沒(méi)有顯著影響，故選擇2.0%作為酶的最佳添加量。

2.3.2? 酶解pH值

酶解pH值分別為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0時(shí)的多糖得率見(jiàn)圖2。當(dāng)pH值增加到5.0時(shí)，多糖得率達(dá)到最大值13.72%，pH值為6.0時(shí)多糖得率反而減小，這主要與pH值過(guò)高或過(guò)低影響酶本身活性有關(guān)，故酶解最適pH值選定為5.0。

2.3.3? 酶解溫度

酶解溫度分別為30、40、50、60 ℃時(shí)的多糖得率見(jiàn)圖3。隨著溫度升高，多糖得率先增大后減小，這是由于溫度過(guò)高導(dǎo)致酶活力減弱所致，故選擇最適酶解溫度為50 ℃。

2.3.4? 酶解時(shí)間

酶解時(shí)間分別為20、40、60、80、100 min的多糖得率見(jiàn)圖4。當(dāng)酶解時(shí)間為60 min時(shí)，多糖得率為13.68%，接近80 min時(shí)的最大值13.76%，再延長(zhǎng)提取時(shí)間，多糖得率反而減小。這是因?yàn)槊附鈺r(shí)間過(guò)長(zhǎng)，酶催化活性減弱，反而不利于多糖提取?？紤]到實(shí)際生產(chǎn)效率，故選擇60 min為最佳酶解時(shí)間。

2.4? 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)自變量為酶解pH值、酶解時(shí)間、酶添加量、酶解溫度4個(gè)因素，以多糖得率為響應(yīng)值，采用Design Expert 8.06軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。因素水平見(jiàn)表1，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2，回歸模型方差分析見(jiàn)表3。

對(duì)表2中數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，獲得自變量（酶解pH、酶解時(shí)間、酶添加量、酶解溫度）對(duì)金果欖多糖得率的二次多項(xiàng)回歸方程：Y=13.86-0.19A-0.64B-0.17C+0.98D-1.86AB-0.61AC+2.07AD-0.56BC+0.41BD+0.17CD-2.06A2-2.49B2-0.74C2-1.65D2。方差分析結(jié)果顯示，回歸方程模型P<0.000 1，失擬項(xiàng)不顯著（P=0.1145），模型總決定系數(shù)R2=0.980 1，調(diào)整后R2Adj=0.960 2，以上參數(shù)均說(shuō)明該模型與試驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合程度好，試驗(yàn)誤差小，可用于不同變量條件下的響應(yīng)值預(yù)測(cè)。

由表3中F值可知，金果欖多糖復(fù)合酶法提取影響因素主次順序?yàn)椋好附鉁囟龋―）>酶解時(shí)間（B）>酶解pH值（A）>酶添加量（C），其中D、B兩因素影響顯著。因素間交互作用對(duì)金果欖多糖得率的影響見(jiàn)圖5，由圖5、表3可知，AB、AC、AD、BC交互作用顯著影響金果欖多糖酶法提取的得率，其中AB、AD影響極顯著，AC、BC顯著，BD、CD間交互作用對(duì)多糖得率影響不顯著（P>0.05）。

2.5? 最佳提取條件預(yù)測(cè)及驗(yàn)證試驗(yàn)

對(duì)回歸模型方程求解，獲得金果欖多糖復(fù)合酶提取的最佳條件為：酶解pH值5.1，酶解時(shí)間56.3 min，酶添加量2.0%，酶解溫度52.2 ℃。在此條件下，理論多糖得率為14.12%。考慮實(shí)際操作方便，將上述最佳提取工藝參數(shù)修改為：酶解pH值5.1，酶解時(shí)間56 min，酶添加量2.0%，酶解溫度52 ℃。按照該工藝條件進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果多糖得率平均值為（14.03±1.25）%，與理論多糖得率的相對(duì)誤差為0.64%，提示本法得到的回歸模型有效、可靠，該復(fù)合酶提取金果欖多糖工藝條件具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

2.6? 體外抗氧化活性測(cè)定

參照文獻(xiàn)[11]方法測(cè)定金果欖多糖清除DPPH自由基、O2-·能力，檢測(cè)波長(zhǎng)分別為517、320 nm。測(cè)定金果欖多糖清除·OH能力的具體步驟按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，檢測(cè)波長(zhǎng)536 nm?？寡趸钚詸z測(cè)均選擇維生素C作為對(duì)照。樣品金果欖多糖及維生素C的質(zhì)量濃度梯度設(shè)置為0.2、0.6、1.0、1.4、1.8、2.2、2.6、3.0 mg/mL。

2.6.1? 金果欖多糖對(duì)DPPH自由基清除作用

金果欖多糖對(duì)DPPH自由基清除作用見(jiàn)圖6。當(dāng)金果欖多糖濃度在0.2～3.0 mg/mL時(shí)對(duì)DPPH自由基清除率穩(wěn)步提升，濃度為3.0 mg/mL時(shí)，金果欖多糖對(duì)DPPH自由基清除率為81.96%，維生素C對(duì)DPPH自由基清除率可達(dá)90.45%，金果欖多糖清除DPPH自由基的半數(shù)抑制濃度（IC50）為1.358 mg/mL，維生素C的IC50為0.867 mg/mL，兩者比較，金果欖多糖清除能力弱于維生素C。以上結(jié)果提示金果欖多糖具有一定的DPPH自由基清除作用。

2.6.2? 金果欖多糖對(duì)羥自由基清除作用

金果欖多糖對(duì)羥自由基清除作用見(jiàn)圖7。當(dāng)金果欖多糖濃度在0.2～3.0 mg/mL時(shí)對(duì)·OH清除率不斷增大，而維生素C在濃度1.8 mg/mL時(shí)對(duì)·OH清除率已接近最大值，之后趨于穩(wěn)定。當(dāng)濃度為3.0 mg/mL時(shí)，金果欖多糖對(duì)·OH清除率為92.05%，維生素C對(duì)·OH清除率為96.74%，金果欖多糖清除·OH的IC50為0.927 mg/mL，維生素C的IC50為0.591 mg/mL，兩者比較，維生素C對(duì)·OH清除能力強(qiáng)于金果欖多糖。以上結(jié)果提示金果欖多糖具有較好的·OH清除作用。

2.6.3? 金果欖多糖對(duì)超氧陰離子自由基清除作用

金果欖多糖對(duì)超氧陰離子自由基清除作用見(jiàn)圖8。當(dāng)金果欖多糖濃度在0.2～3.0 mg/mL時(shí)對(duì)O2-·清除率穩(wěn)步提升，濃度為3.0 mg/mL時(shí)，金果欖多糖對(duì)O2-·清除率為83.12%，維生素C對(duì)O2-·清除率為91.48%，金果欖多糖清除O2-·的IC50為1.096 mg/mL，維生素C的IC50為0.804 mg/mL，兩者比較，金果欖多糖對(duì)O2-·清除能力弱于維生素C。以上結(jié)果說(shuō)明金果欖多糖具有較好的O2-·清除作用。

3? 討論

酶法提取中藥有效成分操作簡(jiǎn)單、條件較溫和、節(jié)約能源、不需要大型設(shè)備，并且在成分結(jié)構(gòu)與生物活性保持方面具有一定的優(yōu)勢(shì)[12]。本研究在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)考察了金果欖多糖復(fù)合酶法提取的工藝。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，金果欖多糖最佳酶解提取條件為：酶解pH值5.1，酶解時(shí)間56 min，復(fù)合酶添加量2.0%，酶解溫度52 ℃，液料比20 mL/g。在此最佳工藝條件下，金果欖多糖得率為14.03%，與回歸模型方程預(yù)測(cè)值14.12%比較，相對(duì)誤差<5%。4個(gè)影響因素中，酶解溫度對(duì)金果欖多糖得率的影響最明顯，其次是酶解時(shí)間和酶解pH值，而復(fù)合酶添加量對(duì)多糖得率影響最小。趙成剛等[13]采用熱水浸提法提取金果欖多糖，在提取時(shí)間1.5 h、提取溫度80 ℃、料液比1∶20、提取3次的工藝條件下，多糖得率為13.64%，稍低于本研究中復(fù)合酶法提取獲得的金果欖多糖得率。本研究選擇的酶法提取溫度為52 ℃，明顯低于熱水浸提法所需的80 ℃，提取溫度低在多糖成分結(jié)構(gòu)與活性保持及節(jié)能方面具有一定優(yōu)勢(shì)。且酶法提取時(shí)間也比水提法明顯縮短，可在一定程度上提高生產(chǎn)效率。

機(jī)體多種疾病如炎癥、心腦血管病等的產(chǎn)生均與自由基及其代謝產(chǎn)物誘發(fā)機(jī)體氧化損傷有關(guān)。鄧曉梅[14]研究指出，金果欖總皂苷對(duì)·OH、亞硝酸鹽、O2-·的清除能力隨其濃度增大而遞增。目前有關(guān)金果欖多糖抗氧化活性的研究很少見(jiàn)。本研究發(fā)現(xiàn)，金果欖多糖對(duì)DPPH自由基、·OH、O2-·均具有較強(qiáng)的清除能力，且濃度與自由基清除能力呈現(xiàn)一定的正相關(guān)關(guān)系;但與維生素C比較，金果欖多糖對(duì)DPPH自由基、·OH、O2-·的清除能力較弱。本研究結(jié)果可為金果欖多糖藥用價(jià)值的開(kāi)發(fā)及其抗氧化活性的深入研究提供一定的依據(jù)。

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（收稿日期：2018-07-31）

（修回日期：2018-08-17;編輯：陳靜）