張巖 周雯 肖韓艷

[摘要] 目的 研究姜黃素對人單核細胞（THP-1）源性巨噬泡沫細胞B類1型清道夫受體（SR-B1）表達的影響。 方法 使用不同濃度姜黃素（12.5、25、50 mg/L）作用于THP-1巨噬泡沫細胞，觀察三組不同濃度姜黃素作用的THP-1源性巨噬泡沫細胞SR-B1表達情況。 結(jié)果 僅50 mg/L姜黃素作用24 h細胞存活率低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;其他濃度及時間姜黃素組細胞存活率與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。50 mg/L姜黃素組SR-B1、TRAF6、NF-κB以及IRAK1 mRNA表達水平明顯低于其他組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;25 mg/L姜黃素組上述指標(biāo)表達水平低于12.5 mg/L姜黃素組和對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;12.5 mg/L姜黃素組與對照組上述指標(biāo)表達水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。 結(jié)論 一定濃度姜黃素可抑制THP-1源性巨噬泡沫細胞中SR-B1、TRAF6、NF-κB以及IRAK1 mRNA的表達，從而減少泡沫細胞，達到抗動脈粥樣硬化的目的。

[關(guān)鍵詞] 姜黃素;THP-1源性巨噬泡沫細胞;SR-B1

[中圖分類號] R543.5? ? ? ? ? [文獻標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2019）07-0026-04

[Abstract] Objective To investigate the effect of curcumin on the expression of class B type 1 scavenger receptor（SR-B1）in human monocyte-derived（THP-1）-derived macrophage foam cells. Methods Different concentrations of curcumin（12.5， 25， 50 mg/L） were used to treat THP-1 macrophage foam cells， and the expression of SR-B1 in THP-1 derived macrophage foam cells treated with different concentrations of curcumin was observed. Results The survival rate of only 50 mg/L curcumin for 24 h was lower than that of the control group， and the difference was statistically significant（P<0.05）. There was no significant difference between the other concentrations and time of curcumin group and the control group（P>0.05）. The expression levels of SR-B1， TRAF6， NF-κB and IRAK1 mRNA in the 50 mg/L curcumin group were significantly lower than those in the other groups， and the difference was statistically significant（P<0.05）. The expression level of the above indicators in the 25 mg/L curcumin group was lower than that of the 12.5 mg/L curcumin group and control group， and the difference was statistically significant（P<0.05）. There was no statistically significant difference between the 12.5 mg/L curcumin group and the control group in the above indicators （P>0.05）. Conclusion Certain concentration of curcumin can inhibit the expression of SR-B1， TRAF6， NF-κB and IRAK1 mRNA in THP-1 derived macrophage foam cells， thereby reducing foam cells and achieving anti-atherosclerosis.

[Key words] Curcumin;THP-1-derived macrophage foam cells;SR-B1

動脈粥樣硬化（AS）是目前冠心病、心肌梗死、腦出血、腦梗死等常見心腦血管疾病的主要原因[1]。研究顯示[2]，脂質(zhì)在巨噬細胞中聚集成泡沫細胞，是AS發(fā)生發(fā)展的重要病理特征，因此如何抑制脂質(zhì)的積累，減少泡沫細胞的形成是防治AS的關(guān)鍵。姜黃素中含有姜黃成分，具有抗炎、抗氧化、抗血小板聚集、抗性、調(diào)脂、保護血管內(nèi)皮等作用[3]。目前大量研究顯示[4-5]，姜黃素具有抗AS的作用，多數(shù)學(xué)者認為這是由于姜黃素具有顯著調(diào)脂作用，參與調(diào)解膽固醇的攝入和流出，從而減少泡沫細胞的形成。因此本文通過研究姜黃素對THP-1源性巨噬泡沫細胞SR-B1表達的影響，從而探討姜黃素在抗動脈粥樣硬化中的作用和機制，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

采用由中科院上海細胞生物所細胞中心提供的THP-1源性巨噬泡沫細胞;由美國Gibco公司提供的RPMI1640培養(yǎng)基;立陶宛Fermentas公司生產(chǎn)的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒;北京百泰克生物科技有限公司提供的TRIzol試劑盒。由上海生工生物工程有限公司合成的SR-B1引物序列。新生牛血清購自四季青生物工程材料有限公司。姜黃素（LPS）由美國Sigma公司提供。由廣州市銳博生物科技有限公司合成的siRNA。

1.2 方法

1.2.1 低密度脂蛋白的分離、氧化修飾及鑒定? 采用序列超速離心法制備LDL，采用10 μmol/L CuSO4氧化修飾成氧化低密度脂蛋白（ox-LDL），采用0.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定修飾程度，過濾除菌，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 細胞培養(yǎng)? 采用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)THP-1細胞，于37℃下5% CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。每3天傳代1次。傳代后第1天收集細胞，以4×106個接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，每個培養(yǎng)瓶含8 mL培養(yǎng)基，再加入100 μmol/L佛波酯8 μL，使PMA終濃度為100 nmol/L。于37℃下5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，顯微鏡下觀察細胞呈貼壁狀態(tài)，形狀不規(guī)則并有偽足伸出，證實THP-1已分化為巨噬細胞。

1.2.3 油紅O染色? 將細胞培養(yǎng)于放有無菌蓋玻片的6孔培養(yǎng)基中，處理后用PBS緩沖液沖洗3次，5 min/次。50%異丙醇固定1 min，油紅O染色液染色10 min，蘇木素染色2 min，鹽酸酒精粉色6 s，水性封片劑封片。

1.2.4 不同濃度姜黃素對THP-1細胞的作用? 將THP-1細胞按每孔1×106個/mL接種于培養(yǎng)板，每個孔加入不同濃度姜黃素，分別為12.5 mg/L、25 mg/L以及50 mg/L，以空白組作為陰性對照組，在不同時間段觀察THP-1細胞存活情況。

1.2.5 RT-PCR分析THP-1細胞中SR-B1、TRAF6、NF-κB以及IRAK1 mRNA表達? 將THP-1源性巨噬泡沫細胞按Invitrogen公司的Trizol試劑盒說明書提取細胞總RNA，瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度法檢測RNA濃度、純度。2 μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，取1 μL逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行PCR循環(huán)，94℃下預(yù)變4 min，94℃下變性1 min，59℃下退火1 min，72℃選延伸1 min，72℃下延伸10 min。共進行34個循環(huán)。SR-B1引物序列，上游引物：5'-AATCCGGAGCCAAGAGAAAT-3'。下游引物：5'-TCCCTGAGTGTCTGCACAAG-3'。PCR擴增產(chǎn)物長度為354bp。取RT-PCR產(chǎn)物置于1.2%瓊脂糖凝膠電泳中電泳，加入10 μL反應(yīng)產(chǎn)物，內(nèi)參加樣量3 μL，溴化乙錠染色。電泳帶使用UVP型凝膠圖像分析系統(tǒng)進行積分吸光度測定。參照Genebank設(shè)計合成TRAF6、NF-κB以及IRAK1引物。PCR反應(yīng)采用兩步溫控法。TRAF6退火溫度62℃，循環(huán)次數(shù)40次，PCR擴增產(chǎn)物長度為374bp。TRAF6上游引物：5'-TTGGCTGAGCGGAGTCGT-3'。下游引物：5'-GCAGGCTTTGCAGAACCTAT-3'。NF-κB退火溫度60℃，循環(huán)次數(shù)25次，PCR擴增產(chǎn)物長度為945bp。NF-κB上游引物：5'-GAGGTGTATTTCACGGGACC-3'。下游引物：5'-GAAGTCCATGTCCGCAATGG-3'。IRAK1退火溫度59℃，循環(huán)次數(shù)40次，PCR擴增產(chǎn)物長度為107bp。IRAK1上游引物：5'-AGTTGGGAGCATGGC-AGAC-3'。下游引物：5'-CGCAAGAGGACACTCG-GGACC-3'。反應(yīng)產(chǎn)物在含有1 mg/L溴化乙啶的20 g/L瓊脂糖凝膠中電泳，電壓100 V。采用相關(guān)軟件掃描電泳帶吸光度值，計算鎘濃度藥物對目的基因mRNA的表達抑制率。上述實驗均重復(fù)三次取平均值。

1.3 觀察指標(biāo)

觀察三組不同濃度姜黃素及對照組作用6 h、12 h及24 h時對THP-1源性巨噬泡沫細胞存活率的影響。分析三組不同濃度姜黃素和對照組中SR-B1、TRAF6、NF-κB以及IRAK1 mRNA的表達水平。細胞存活率=姜黃素作用后細胞計數(shù)/姜黃素作用前細胞計數(shù)×100%。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件，計數(shù)資料用百分比表示，采用χ2檢驗，計量資料用（x±s）表示，采用t檢驗，多組間資料對比采用方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度姜黃素及對照組不同時間對THP-1源性巨噬泡沫細胞存活率的影響

僅50 mg/L姜黃素作用24 h細胞存活率低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;其他濃度及時間姜黃素組細胞存活率與對照組對比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表1。

2.2 姜黃素對THP-1細胞SR-B1、TRAF6、NF-κB以及IRAK1 mRNA表達的影響

50 mg/L姜黃素組SR-B1、TRAF6、NF-κB以及IRAK1 mRNA表達水平明顯低于其他組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;25 mg/L姜黃素組上述指標(biāo)表達水平低于12.5 mg/L姜黃素組和對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;12.5 mg/L姜黃素組與對照組上述指標(biāo)表達水平對比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表2。

3 討論

近年來隨著我國人口老齡化的加劇以及人們生活習(xí)慣的改變，AS發(fā)生率不斷升高，引起專家學(xué)者的關(guān)注和重視[6]。雖然AS的發(fā)病機制尚未完全明確，但大部分學(xué)者認為AS的發(fā)生發(fā)展與脂質(zhì)沉積、氧化修飾、炎癥反應(yīng)等有關(guān)[7-8]。血脂代謝經(jīng)過氧化修飾后形成的ox-LDL極易引起血管內(nèi)皮損傷，導(dǎo)致膽固醇在內(nèi)皮下沉積，引起巨噬細胞的遷移和吞噬，脂質(zhì)在巨噬細胞中形成泡沫細胞是引起AS的主要原因之一[9-10]。因此抑制脂質(zhì)積累、減少泡沫細胞的形成成為防治AS的關(guān)鍵。

巨噬泡沫細胞主要依靠SR-B1等因子的逆轉(zhuǎn)錄，從而排出膽固醇[11]。SR-B1是HDL中膽固醇逆轉(zhuǎn)運的重要受體，參與了人體內(nèi)膽固醇逆向轉(zhuǎn)運過程。SR-B1抗AS的機制可能為：①介導(dǎo)肝臟吸收和HDL膽固醇的膽汁分泌，調(diào)節(jié)膽固醇的逆轉(zhuǎn)運，抑制AS的發(fā)生和發(fā)展[12];②AS斑塊上巨噬泡沫細胞中SR-B1的表達也會影響HDL和細胞間膽固醇的流出[13];③可能抑制了血漿動脈粥樣脂蛋白積累[14];④SR-B1的表達可能控制血紅細胞的成熟，預(yù)防機體貧血[15]。因此SR-B1因子的表達可能影響了脂蛋白的代謝，對AS的發(fā)生發(fā)展具有重要影響。

姜黃素中主要成分為姜黃，有較廣泛的藥理作用，包括抗氧化、抗炎、降血壓、保護血管內(nèi)皮、調(diào)脂等。AS與氧化反應(yīng)、炎癥反應(yīng)等密切相關(guān)[16]。而姜黃素在臨床上被證實具有抗AS作用。因此姜黃素抗AS作用的機制可能為：①通過調(diào)節(jié)LDL受體，降低血液中膽固醇水平[17];②姜黃素能調(diào)節(jié)載脂蛋白B（apoB）的表達，使apoB表達為血漿清除更快的apoB48亞型，減少apoB表達為血漿清除較慢的apoB100亞型和LDL-C[18];③姜黃素可能通過NF-κB、TLR4等通路影響SR-A1、SR-B1的表達水平，從而參與膽固醇的調(diào)節(jié)[19]。在本研究中，采用三組不同濃度的姜黃素對THP-1源性巨噬泡沫細胞進行處理，以空白組作為對照，結(jié)果顯示，50 mg/L濃度的姜黃素處理24 h，THP-1源性巨噬泡沫細胞存活率明顯降低，而其他濃度及時間的細胞存活率與對照組并無差異，結(jié)果提示50 mg/L以姜黃素12 h內(nèi)對THP-1源性巨噬泡沫細胞基本無毒性。在觀察姜黃素對THP-1細胞SR-B1、TRAF6、NF-κB以及IRAK1 mRNA表達的影響時發(fā)現(xiàn)，50 mg/L姜黃素組SR-B1、TRAF6、NF-κB以及IRAK1 mRNA表達水平明顯低于其他組;25 mg/L姜黃素組上述指標(biāo)表達水平低于12.5 mg/L姜黃素組和對照組;12.5 mg/L姜黃素組與對照組上述指標(biāo)表達水平無差異。結(jié)果表明12.5 mg/L姜黃素對上述細胞因子的表達水平基本無影響，而超過12.5 mg/L濃度的姜黃素對上述基因表達水平具有明顯抑制作用。提示姜黃素可能通過抑制SR-B1、TRAF6、NF-κB以及IRAK1 mRNA的表達水平，從而對THP-1源性巨噬泡沫細胞產(chǎn)生殺傷作用，起到抗AS的作用[20]。

綜上所述，一定濃度姜黃素可抑制THP-1源性巨噬泡沫細胞中SR-B1、TRAF6、NF-κB以及IRAK1 mRNA的表達，從而減少泡沫細胞，達到抗動脈粥樣硬化的目的。

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（收稿日期：2018-10-29）