趙錦花， 崔龍吉， 金玉善， 李光雄， 池敬姬， 李 鋒， 李河霖， 李東浩*

(1.延邊大學(xué)理學(xué)院化學(xué)系，長白山生物資源與功能分子教育部重點實驗室，吉林延吉 133002; 2.吉林煙草工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，吉林延吉 133000)

香豆素化學(xué)名稱為1，2-苯并吡喃酮，它是一種有芳香氣味的芳香族內(nèi)酯類化合物，在蕓香科和傘形科植物中存在較多，其次是在蘭科、豆科、菊科、茄科等植物中分布較為廣泛[1]。香豆素通常被作為香料，用作定香劑配制香水香料，也用作于香煙、食品中的增香劑。黃樟素是許多食用天然精油，如黃樟精油、八角精油和樟腦油的主要成分[2]，天然存在于沉水樟、堅葉樟等樟屬植物精油中[3]。香豆素在動物體內(nèi)能引起肝臟毒性，自1954年起美國禁止將香豆素用于食品添加劑[4]。近期研究表明，黃樟素能在肝臟組織中形成黃樟素-脫氧核糖核酸加合物，易誘發(fā)基因突變和肝臟損傷，是消化系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、血液系統(tǒng)的強致癌物質(zhì)[5]。我國在2005年開始實施的《易致毒化學(xué)品管理條例》中將黃樟素列為第一類易致毒化學(xué)品[6]。香精香料起到改善卷煙的刺激性、掩蓋雜氣、提高卷煙感官品質(zhì)的作用[8]，而在添加香精香料過程中，香豆素和黃樟素[7]都會帶入到香煙中。

目前，香豆素和黃樟素的樣品前處理方法有超聲萃取[9]、微波輔助萃取[10]、頂空固相微萃取[11]、分散液液微萃取[12]，而檢測方法有氣相色譜-質(zhì)譜法[13 - 16]和高效液相色譜-紫外法[8,17 - 19]等。氣流吹掃-微注射器萃取(GP-MSE)樣品前處理技術(shù)是基于液相微萃取技術(shù)發(fā)展起來的一種新型的半開放式液相微萃取技術(shù)，其基本原理如下：將惰性氣體引入到樣品基質(zhì)表面，使惰性氣體與氣相中目標(biāo)物混合，帶動目標(biāo)物不斷的向萃取溶劑運動，目標(biāo)物被萃取溶劑吸附，惰性氣體流出萃取體系，該過程被不斷重復(fù)，直到萃取結(jié)束。GP-MSE是集樣品萃取、凈化、濃縮為一體的液相微萃取技術(shù)，已廣泛應(yīng)用于大氣污染物檢測[19]、食品中農(nóng)藥殘留檢測[20]、石油成分檢測[21]等領(lǐng)域。該技術(shù)能快速同時萃取揮發(fā)性和半揮發(fā)性成分，解決了液相微萃取技術(shù)富集率低、萃取范圍窄、液滴不穩(wěn)定而重現(xiàn)性差等問題[22]。本研究利用GP-MSE樣品前處理技術(shù)與氣相色譜-質(zhì)譜(GC/MS)聯(lián)用技術(shù)，快速、準(zhǔn)確分析了卷煙產(chǎn)品中的香豆素和黃樟素的含量。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

2010 Ultra型GC/MS儀(日本，島津公司)；AS20500AH型超聲波清洗器(天津AU-TO-SCIENCE公司)；XPE105電子天平(瑞士，梅特勒-托利多公司)；FW-100高速萬能粉碎機(jī)(天津泰斯特儀器有限公司)；GP-MSE微萃取儀(延吉艾迪扼科技有限公司)。

香豆素標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥99.0%)購買自德國Dr.Ehrenstorfer)；黃樟素標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥99.0%)購買自美國AccuStandard)。標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液：準(zhǔn)確稱取0.0500 g香豆素和0.0500 g黃樟素標(biāo)準(zhǔn)品，置于100 mL容量瓶中，用甲醇稀釋定容至刻度并搖勻，得到500.0 mg·L-1混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。然后用甲醇再稀釋至濃度為5 mg·L-1工作溶液，置于冰箱冷藏儲存。甲醇、正己烷、二氯甲烷、丙酮均為色譜純；0.45 μm有機(jī)膜(美國PALL)；玻璃棉(400 ℃下活化10 h)。

1.2 樣品制備

1.2.1超聲萃取準(zhǔn)確稱取5.000 g香煙樣品，加入5個不同含量的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，制備系列加標(biāo)樣品。用15 mL正己烷超聲萃取，每次10 min，共3次。將3次萃取液合并后0.45 μm有機(jī)膜過濾，用吹氮儀濃縮，定容至500 μL，待GP-MSE微萃取儀再處理。

1.2.2GP-MSE取上述萃取液20 μL，加載到GP-MSE萃取儀樣品槽中，在萃取溫度為160 ℃，萃取時間為4 min，氣體流速為2 mL·min-1，冷凝溫度為-4 ℃的條件下進(jìn)行萃取，萃取溶劑為正己烷。萃取結(jié)束后，加入10 mg·L-1d10-Phe 10 μL儀器內(nèi)標(biāo)，定容至100 μL，取2 μL進(jìn)行GC/MS分析。

1.3 GC/MS 分析條件

色譜柱為DB-5 MS石英毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；載氣為氦氣(純度≥99.999%)，流速為0.98 mL·min-1。色譜柱升溫程序如下：初始溫度為100 ℃，保持3 min，以6 ℃·min-1升高至180 ℃，再以20 ℃·min-1升高至280 ℃，保持5 min。進(jìn)樣口溫度為280 ℃，離子源溫度為200 ℃。利用全掃描模式確認(rèn)保留時間和離子分布及特征離子，實際樣品分析時采用了選擇離子監(jiān)測模式。選擇的特征離子分別是香豆素為m/z89、90、118、146；黃樟素為m/z104、131、135、162。以m/z118和m/z162分別為兩個目標(biāo)物的定量離子。

2 結(jié)果與討論

2.1 萃取溶劑選擇

煙葉的主要化學(xué)成分是纖維素(11%)、半纖維素(20%)、果膠(12%)、蛋白質(zhì)(5%～15%)、尼古丁(1.5%～30%)以及有機(jī)酸(12%～16%)等[22]。其中，尼古丁和有機(jī)酸對煙葉中黃樟素和香豆素的GC/MS檢測干擾大。萃取溶劑的選擇直接影響被分析物的萃取效率和共提取物的基質(zhì)效應(yīng)。為了消除這些干擾物的影響，選擇正己烷、二氯甲烷和丙酮等不同極性溶劑，考察了不同萃取溶劑對黃樟素和香豆素萃取率以及對尼古丁的消除率。通過萃取溶劑優(yōu)化實驗發(fā)現(xiàn)，尼古丁的消除率隨著萃取溶劑的極性遞減而增大，即當(dāng)正己烷作為萃取溶劑時尼古丁的影響最小，并且不影響黃樟素和香豆素的定性定量，故萃取溶劑選為正己烷。

2.2 萃取溫度的優(yōu)化

在GP-MSE過程中解析溫度是影響萃取效率的主參數(shù)[23]。選擇140、160、180、220、260和300 ℃等不同溫度，進(jìn)行了解析溫度對萃取率的影響研究。玻璃棉作為空白基質(zhì)，加入1 mg·L-1香豆素和黃樟素的混標(biāo)10 mL進(jìn)行實驗。實驗結(jié)果如圖1所示，除了140 ℃條件之外，在160和300 ℃萃取溫度范圍內(nèi)的萃取率均滿足分析要求，回收率分別是87%～99%和86%～98%，RSD均小于11.4%，最終選擇了160 ℃為最佳萃取溫度。

2.3 萃取時間的優(yōu)化

參照文獻(xiàn)報道[24]，對上述樣品，分別選擇3、4、5 min的萃取時間進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明在一定的萃取時間范圍內(nèi)，萃取時間對萃取率的影響不大，香豆素和黃樟素的回收率為96%～118%和100%～112%，RSD值小于15%。上述萃取時間均滿足分析要求，最終選擇4 min為最佳萃取時間，見圖2。

圖1 萃取溫度對香豆素和黃樟素萃取效率的影響Fig.1 Effect of extraction temperature on the extraction efficiency of coumarin and safrole

圖2 萃取時間對香豆素和黃樟素萃取效率的影響Fig.2 Effect of extraction time on the extraction efficiency of coumarin and safrole

2.4 加標(biāo)回收率

圖3 不同加標(biāo)量對香豆素和黃樟素萃取效率的影響Fig.3 Effect of spiked amount on the extraction efficiency of coumarin and safrole

因煙葉基質(zhì)復(fù)雜，尤其是尼古丁含量比較多，嚴(yán)重影響煙葉中揮發(fā)性和半揮發(fā)性物質(zhì)的檢測。為了考察香煙基質(zhì)對檢測香豆素和黃樟素的影響，進(jìn)行了基質(zhì)加標(biāo)實驗。在香煙基質(zhì)中分別添加1.0、5.0、50.0、500.0 ng的香豆素和黃樟素，考察了加標(biāo)回收率，見圖3。結(jié)果顯示，在上述濃度區(qū)間內(nèi)，香豆素和黃樟素的回收率分別是80%～87%和83%～97%，RSD值均小于10.6%。

2.5 方法評價

2.5.1線性關(guān)系本研究使用外標(biāo)法對香煙中香豆素和黃樟素的含量進(jìn)行定量分析。分別取0.05、0.10、0.50、5.00、20.00、30.00和50.00 mg·L-1的香豆素和黃樟素混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液2.0 μL，進(jìn)行GC/MS分析，以相應(yīng)的色譜峰強度和濃度分別作為縱坐標(biāo)和橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。如圖5所示，香豆素和黃樟素標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2分別為0.9998和0.9993。

圖4 香豆素和黃樟素的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Calibration curve of coumarin(a) and safrole(b)

2.5.2檢出限方法的檢出限(LOD)和定量限(LOQ)分別按3倍信噪比和10倍信噪比計算而獲得。香豆素的LOD為0.021 μg·g-1，LOQ為0.07 μg·g-1；黃樟素的LOD和LOQ分別為0.015、0.05 μg·g-1。

2.6 實際樣品檢測

購買市場上普遍銷售的10個品牌香煙樣品，分別編為樣品1#～10#,檢測了其中香豆素和黃樟素的含量。具體含量如表1。在大部分樣品中沒有檢測到黃樟素，而香豆素的檢出量為0～230 ng·g-1。

表1 香煙中檢測到的黃樟素和香豆素的含量(μg·g-1)

ND：not detected.

3 結(jié)論

本研究建立了香煙中香豆素和黃樟素的氣流吹掃-微注射器萃取-氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用檢測方法，香豆素和黃樟素的加標(biāo)回收率分別為80%～87%、83%～97%，RSD均值小于10.6%，檢出限分別為0.021、0.015 mg·g-1,定量限分別為0.07、0.05 mg·g-1。利用本方法成功檢測了香煙中的黃樟素和香豆素含量，樣品中未檢測到黃樟素，香豆素的檢出量為0～230 ng·g-1。此方法具有快速、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)、綠色及簡便等優(yōu)點，在煙卷產(chǎn)品的質(zhì)量控制領(lǐng)域具有良好應(yīng)用前景。