馬 輝，卞紫秀，陳雪怡，儲 鈺，王順民

(安徽工程大學 生物與化學工程學院，安徽 蕪湖 241000)

苦蕎麥(FagopyrumtataricumGaertn.)富含蘆丁和槲皮素等黃酮類化合物[1]，具有很好的抗氧化、抗炎癥和抗癌癥等作用[2-4]，是一種藥食兩用的重要作物。長期食用苦蕎對軟化血管、降血糖、降血脂、降血壓和增強人體免疫力具有積極作用[5-6]。近年來，大量研究表明，采用微波[7]、激光[8]、超聲波[9]和磁場[10]等物理方法處理種子能夠對其萌發(fā)過程產(chǎn)生一定的誘導效應和生物效應。微波是一種電磁波，對種子進行輻照能夠產(chǎn)生大量的熱量[11]，使種子內部蛋白質和淀粉的分子結構改變[12]，從而影響種子在萌發(fā)過程中的生理生化性狀。Maqueda[13]和Audrius[14]的研究證實，微波能夠提高植物種子的萌發(fā)率與芽苗的活力。除此之外，適當?shù)奈⒉ㄝ椪者€能夠顯著增加游離氨基酸、還原糖、總酚及總黃酮的積累量[7,15]。因此，微波輻照對增加苦蕎種子、芽苗的活力與芽苗中營養(yǎng)成分的富集具有重要意義。

苯丙氨酸(Phenylalanine，Phe)屬于芳香族氨基酸，是植物生長發(fā)育所必需的氨基酸之一。作為苯丙烷代謝的前體物質，連接著初級代謝和苯丙烷類次級代謝，對植物的初級代謝及苯丙烷代謝起著重要作用[16]。研究表明，使用適量的外源Phe處理能夠刺激苦蕎芽苗中碳水化合物、總酚[17]和黃酮類物質[18]的積累量的增加。Ozturk[19]采用HPLC分析表明，添加外源L-phe能夠誘導沒食子酸、反式肉桂酸、對香豆酸、阿魏酸等酚類化合物的積累量顯著增加。Seo[20]證實，5 mM的外源L-phe處理對酚類化合物積累的促進效應最佳，同時，苯丙烷類代謝途徑中CHI和FLS兩種酶的基因表達量也顯著增加。Md-Mustafa[21]表明，外源Phe處理下，總酚和總黃酮積累量的增加是由于刺激了苯丙烷類代謝途徑中苯丙氨酸解氨酶和查爾酮合成酶基因的表達。因此，通過添加適量L-phe來調控苦蕎萌發(fā)過程中多種營養(yǎng)成分的合成是一種科學有效的方法。

目前關于采用微波和外源Phe分別處理種子萌發(fā)的研究較多，而關于微波協(xié)同外源Phe處理對苦蕎萌發(fā)過程中營養(yǎng)成分變化的研究尚未見報道。實驗研究不同微波處理對苦蕎麥種子萌發(fā)率的影響，在萌發(fā)率實驗的基礎上，研究微波條件協(xié)同不同摩爾濃度的外源L-phe處理對苦蕎麥種子在萌發(fā)過程中總酚、總黃酮、還原糖及可溶性總糖含量的影響，為進一步探究苦蕎麥萌發(fā)過程中營養(yǎng)成分變化規(guī)律及深入開發(fā)利用苦蕎提供一定理論基礎。

1 實驗材料與方法

1.1 材料與設備

苦蕎麥(購自四川涼山);L-phe、蘆丁、Al(NO3)3、硫代巴比妥酸、3,5-二硝基水楊酸均為分析純(國藥集團化學試劑有限公司)。

光照種子發(fā)芽箱(YRG-150，上海臺恒儀器設備有限公司)；風力懸浮微波爐(P7021TP-6，安徽工程大學食品系-蕪湖眾維教研儀器研發(fā)公司聯(lián)合開發(fā))；醫(yī)用離心機(TGL-16A，長沙平凡儀器儀表有限公司)；真空冷凍干燥機(LGJ-12，北京松源華興科技發(fā)展有限公司)。

1.2 處理及培養(yǎng)

選取顆粒飽滿的苦蕎種子，1 g/L KMnO4消毒5 min，室溫下使用蒸餾水浸泡4 h(每2 h換水一次)，后置于55 ℃水浴中催芽15 min。催芽結束使種子冷卻至室溫，再按照下述方法進行處理。

(1)微波處理對萌發(fā)率的影響：分別采用400 W 10 s、400 W 30 s、600 W 10 s和600 W 30 s的微波條件處理苦蕎種子。以蒸餾水為培養(yǎng)液，將苦蕎種子置于光照培養(yǎng)箱(設置溫度為25 ℃，濕度為80%)內避光培養(yǎng)，每12 h測定各組苦蕎種子的萌發(fā)率。

(2)L-phe處理對苦蕎種子的影響：以蒸餾水作為培養(yǎng)液，將苦蕎種子置于光照培養(yǎng)箱內避光培養(yǎng)至露白(1.5 d)后，分別采用1 mM、3 mM、5 mM、7 mM和9 mM的L-phe對苦蕎種子進行培養(yǎng)。

(3)微波協(xié)同L-phe處理對苦蕎種子的影響：采用微波(在萌發(fā)率實驗的基礎上)預先處理苦蕎種子，然后以蒸餾水作為培養(yǎng)液，將苦蕎種子置于光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)至露白后，采用不同摩爾濃度的L-phe培養(yǎng)苦蕎種子。

從苦蕎種子露白后開始，培養(yǎng)至第7 d，每12 h換1次新鮮培養(yǎng)液。采收發(fā)芽1 d、3 d、5 d和7 d的長勢均勻的苦蕎芽苗，冷凍干燥后備用。以未經(jīng)微波與L-phe處理的種子作為對照組，每個水平做3次重復。

1.3 總酚含量的測定(Folin-Phenol比色法)

稱取0.2 g苦蕎于研缽中，加入石英砂磨粉。每組的樣品凍干粉中加入5 mL 60%乙醇溶液，在超聲波中水浴浸提30 min(60 ℃)后，于8 000 r/min離心10 min，取上清液至10 mL容量瓶并定容至刻度，備用。參照Ling[22]的方法，在765 nm波長處測定吸光度并根據(jù)沒食子酸標準曲線計算總酚含量。

1.4 總黃酮含量的測定(硝酸鋁顯色法)

稱取0.2 g苦蕎干樣于研缽中粉碎，加入5 mL 60%乙醇溶液，置于超聲波中水浴浸提30 min(60 ℃)后，于9 000 r/min離心15 min，取上清液至10 mL容量瓶并定容至刻度，備用。參照Ling[22]的方法，在502 nm下測定吸光度并根據(jù)蘆丁標準曲線計算總黃酮的含量。

1.5 還原糖含量的測定(DNS法)

采用高俊鳳[23]的方法制備粗糖上清液。取2 mL上清液(剩余上清液用作可溶性總糖含量的測定)于試管中，加入2 mL 3，5-二硝基水楊酸試劑，在沸水浴中準確反應5 min后，立即用流水冷卻至室溫，最終移液至25 mL容量瓶中并定容至刻度，搖勻后于540 nm下測定吸光度并根據(jù)葡萄糖標準曲線計算還原糖的含量。

1.6 可溶性總糖含量的測定(蒽酮-H2SO4法)

采用高俊鳳[23]的方法：取1.5中測定還原糖剩余的上清液1 mL，置于10 mL容量瓶中并定容，取2 mL至試管中，在冰水浴下沿管壁緩慢加入蒽酮-H2SO4試劑，搖勻后置于沸水浴中準確加熱10 min，待反應結束后立即用流水冷卻至室溫，在波長620 nm處測定吸光值并根據(jù)葡萄糖標準曲線計算可溶性總糖的含量。

1.7 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)是將3次重復的結果以平均值±標準差表示，采用SPSS 18.0統(tǒng)計分析軟件對其進行One-way方差分析(ANOVA)，采用SigmaPlot 10.0進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 微波處理對苦蕎麥種子萌發(fā)率的影響

不同微波處理下苦蕎種子萌發(fā)率的變化如圖1所示。由圖1可知，隨著萌發(fā)時間的增加，苦蕎種子的萌發(fā)率在24～48 h快速增加，待萌發(fā)至72 h后，所有處理組和對照組的萌發(fā)率均趨于穩(wěn)定。萌發(fā)24 h，400 W 10 s的微波處理組的萌發(fā)率最高達11.67%，相比對照組增加了52.15%。隨著萌發(fā)時間的增加(24～60 h)，400 W 10 s的微波處理組的萌發(fā)率均高于其他處理組與對照組，當萌發(fā)至108 h，該處理組的萌發(fā)率達到95.33%，與所有處理組及對照組無明顯差異。結果表明，400 W的微波功率處理10 s能夠明顯提高苦蕎種子在萌發(fā)初期的萌發(fā)率(微波協(xié)同L-phe的處理步驟中均采用400 W 10 s的微波條件進行處理)，而對種子的最終萌發(fā)率影響沒有統(tǒng)計學差異。

圖1 不同微波處理下苦蕎種子萌發(fā)率的變化

2.2 微波協(xié)同不同摩爾濃度的L-phe處理對萌發(fā)苦蕎中總酚含量的影響

微波協(xié)同L-phe處理下萌發(fā)苦蕎中總酚含量的變化如圖2所示。由圖2可知，萌發(fā)1～3 d內，隨著萌發(fā)時間的增加芽苗中總酚含量逐漸增加，萌發(fā)5 d時，芽苗中總酚含量最高，而當萌發(fā)至第7 d時，總酚含量有所下降。在萌發(fā)5 d的芽苗中總酚含量變化規(guī)律表現(xiàn)為隨著L-phe摩爾濃度的增加呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，當L-phe的摩爾濃度為5 mM時，芽苗中總酚含量最高達23.11 mg/g，相比對照組增加了16.95%。當采用微波處理(400 W 10 s)協(xié)同L-phe(5 mM)處理時，萌發(fā)5 d的芽苗中總酚含量相對L-phe處理(5 mM)降低了3.68%，而萌發(fā)7 d的芽苗中總酚含量繼續(xù)增加達23.33 mg/g，相比對照組增加了38.37%，得到萌發(fā)7 d內最高的總酚積累量。結果說明，采用適當?shù)谋奖轭惔x前體物質[16]L-phe處理(1～7 mM)能夠明顯提高苦蕎種子萌發(fā)過程中總酚的積累量，且在微波(400 W 10 s)與L-phe(5 mM)的協(xié)同處理下，能夠獲得更高的總酚積累量，這可能與苯丙烷類代謝途徑中CHI和FLS兩種酶基因表達量的增加密切相關[20]。

圖2 微波協(xié)同L-phe處理下萌發(fā)苦蕎中總酚含量的變化

2.3 微波協(xié)同不同摩爾濃度的L-phe處理對萌發(fā)苦蕎中總黃酮含量的影響

微波協(xié)同L-phe處理下萌發(fā)苦蕎中總黃酮含量的變化如圖3所示。由圖3可知，隨著萌發(fā)時間的增加，苦蕎芽苗中總黃酮含量逐漸增加。當采用不同摩爾濃度的L-phe處理時，芽苗中總黃酮含量隨著L-phe摩爾濃度的增加呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。其中，7 mM L-phe處理下萌發(fā)7 d的苦蕎芽苗中總黃酮的積累量最高達4.84 g/100 g，相比對照組增加了28.38%。而當采用微波協(xié)同L-phe處理(5 mM)時，萌發(fā)7 d的芽苗中總黃酮的積累量達到5.10 g/100 g，相比對照組及L-phe處理組(5 mM)分別增加了35.28%和5.37%。結果說明，一定摩爾濃度的L-phe處理(1～7 mM)對苦蕎種子中總黃酮的積累具有促進效應，且一定微波處理(400 W 10 s)協(xié)同一定摩爾濃度的L-phe處理(5 mM)對總黃酮積累的促進效應更佳。

圖3 微波協(xié)同L-phe處理下萌發(fā)苦蕎中總黃酮含量的變化

2.4 微波協(xié)同不同摩爾濃度的L-phe處理對萌發(fā)苦蕎中還原糖含量的影響

微波協(xié)同L-phe處理下萌發(fā)苦蕎中還原糖含量的變化如圖4所示。由圖4可知，苦蕎芽苗中還原糖含量隨著萌發(fā)時間的增加而不斷增加，當萌發(fā)至5 d時，還原糖含量開始出現(xiàn)下降的趨勢。在L-phe處理的萌發(fā)5 d的芽苗中，采用5 mM L-phe處理的芽苗中還原糖含量達5.20 g/100 g，明顯高于其他摩爾濃度的L-phe處理組及對照組。當采用微波處理(400 W 10 s)協(xié)同L-phe處理(1～7 mM)時，5 d的芽苗中還原糖含量相比單獨采用L-phe處理的芽苗明顯增加。有趣的是，在微波協(xié)同L-phe處理下，7 d的芽苗中還原糖含量相比第5 d繼續(xù)增加，當L-phe的摩爾濃度為5 mM時，芽苗中還原糖含量最高達6.56 g/100 g，相比對照組增加了59.61%，這可能與微波輻照改變了淀粉的分子結構而加速其向小分子碳水化合物轉化密切相關[12]。結果說明，一定摩爾濃度的L-phe處理(1～5 mM)能夠有效促進苦蕎芽苗中還原糖含量的增加，而采用一定條件的微波刺激(400 W 10 s)后再使用一定摩爾濃度的L-phe處理(1～7 mM)能夠更好地促進苦蕎芽苗中還原糖含量的增加。

圖4 微波協(xié)同L-phe處理下萌發(fā)苦蕎中還原糖含量的變化

2.5 微波協(xié)同不同摩爾濃度的L-phe處理對萌發(fā)苦蕎中可溶性總糖含量的影響

微波協(xié)同L-phe處理下萌發(fā)苦蕎中可溶性總糖含量的變化如圖5所示。由圖5可知，萌發(fā)1～5 d內，苦蕎芽苗中可溶性總糖含量隨著萌發(fā)時間的增加不斷增加，而萌發(fā)5～7 d內，其含量增加速度緩慢。在萌發(fā)7 d的芽苗中，L-phe處理(1～7 mM)對可溶性總糖的積累表現(xiàn)出了一定的促進效應，且隨著其摩爾濃度的增加可溶性總糖含量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，其中，5 mM的L-phe處理的芽苗中可溶性總糖含量最高達13.07 g/100 g，比對照組增加了10.86%。由圖5a、圖5b、圖5c和圖5d中均可看出，經(jīng)微波預先處理的苦蕎種子在萌發(fā)過程中可溶性總糖含量相比未經(jīng)微波處理有明顯的增加趨勢。當采用微波協(xié)同5 mM的L-phe處理時，7 d的芽苗中可溶性總糖最高達15.11 g/100 g，比對照組和L-phe處理組(5 mM)分別增加了28.16%和15.61%。結果說明，微波處理(400 W 10 s)和L-phe處理(1～7 mM)對苦蕎芽苗中的可溶性總糖含量的增加均具有一定促進效應，且微波(400 W 10 s)協(xié)同L-phe處理(1～9 mM)對芽苗中可溶性總糖含量積累的促進效應更佳。

圖5 微波協(xié)同L-phe處理下萌發(fā)苦蕎中可溶性總糖含量的變化

3 結論

實驗前期研究了微波功率對苦蕎種子萌發(fā)率的影響，結果表明，采用400 W的微波功率處理10 s能夠有效提高苦蕎種子在萌發(fā)初期的萌發(fā)率。Wang[7]的研究表明，600 W的微波功率輻射10 s對苦蕎種子的萌發(fā)率提升最高，與本實驗結果存在不同之處是由于選用的苦蕎種子的產(chǎn)地有所差異。采用400 W 10 s的微波條件協(xié)同不同摩爾濃度的L-phe處理，研究了苦蕎種子萌發(fā)過程中主要成分的變化規(guī)律，結果表明：微波處理(400 W 10 s)能夠提高萌發(fā)苦蕎中總酚、還原糖和可溶性總糖的含量。一定L-phe處理(1～7 mM)能夠提高萌發(fā)苦蕎中總酚、總黃酮的積累量；一定L-phe處理(1～5 mM)能夠提高萌發(fā)苦蕎中還原糖和可溶性總糖的含量。微波(400 W 10 s)協(xié)同一定L-phe處理(5 mM)對萌發(fā)苦蕎中總酚、總黃酮、還原糖和可溶性總糖含量的積累具有較好的促進效應，在此條件下萌發(fā)7 d的苦蕎芽苗中4種成分的含量達到最高。研究為苦蕎麥萌發(fā)過程中營養(yǎng)成分富集方面的研究及深入開發(fā)利用苦蕎提供了一定理論基礎。