杜 娟,陳亞妮,史海燕,吳 博,王愛紅,殷松娜

(延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院中心實驗室,延安 716000;*通訊作者,E-mail:397244582@qq.com)

2018年全球癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示胃癌是繼肺癌、結(jié)腸癌之后死亡率位居第三的惡性腫瘤[1]。全球范圍內(nèi),東亞地區(qū)胃癌的發(fā)病率較美洲等地區(qū)高,而我國屬于胃癌高發(fā)國家,每年約有41萬例新發(fā)病例。胃癌已然是嚴重影響我國居民健康和生存的疾病[2]。然而,胃癌屬于異質(zhì)性疾病,病因復(fù)雜,涉及遺傳、飲食和環(huán)境等多種因素。胃癌發(fā)病早期癥狀不明顯,臨床診斷時常已進入進展期,治療和預(yù)后的效果差[3,4]。為此,探究胃癌發(fā)生、發(fā)展相關(guān)分子及其作用機制對提高胃癌的診斷和治療具有積極作用。

長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,LncRNA)是長度大于200個核苷酸,具有種屬特異性、時空特異性、組織和細胞特異性的RNA分子[5]。在疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中,長鏈非編碼RNA的異常表達被證明與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及免疫逃逸相關(guān)。如,已有研究表明長鏈非編碼RNA能夠通過轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合引導(dǎo)、表觀遺傳學(xué)修飾、microRNA的沉默以及基因表達修飾復(fù)合體的形成等方式調(diào)控腫瘤的生長、遷移[6]。然而,因為細胞內(nèi)存在大量無功能活性的LncRNA,功能LncRNA的篩選鑒定較為困難,很長一段時間內(nèi)LncRNA都被認為是無功能的“垃圾RNA”,相對于其他RNA,大多數(shù)LncRNA的功能及作用機制還未被完全揭示。

LINC00519是位于14q22.1上的,長度為786個核苷酸的基因間長鏈非編碼RNA(intergenic LncRNA,LINCRNA)。在前期研究中,我們通過表達譜數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)LINC00519在多種腫瘤組織中的表達呈上調(diào)趨勢。然而,截止目前還未見LINC00519功能,LINC00519表達量與腫瘤發(fā)生、發(fā)展關(guān)系的相關(guān)研究報道。為了解LINC00519表達量與癌癥發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系,本研究以人胃癌及其配對癌旁組織為材料,利用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測LINC00519在胃癌組織中的表達情況,通過數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)LINC00519表達量與人胃癌發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)性。該研究的進行有助于LINC00519功能的發(fā)現(xiàn),可為LINC00519參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展相關(guān)研究提一定的數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 分析LINC00519在不同腫瘤組織中的表達及其與胃癌患者總生存期的關(guān)系

用在線軟件GEPIA(Gene Expression Profiling Interactive Analysis,http://gepia.cancer-pku.cn/index.html)對TCGA數(shù)據(jù)庫中LINC00519在不同腫瘤組織中的表達情況進行了分析。隨后,用GEPIA軟件對TCGA數(shù)據(jù)庫中胃癌患者癌組織中LINC00519表達量與患者總生存期的關(guān)系進行分析。

1.2 一般資料

以西安交通大學(xué)環(huán)境與疾病相關(guān)基因教育部重點實驗室保存的20例人胃癌組織及其配對癌旁正常組織(經(jīng)病理切片證實)為研究材料。其中,男性10例,平均年齡(64.9 ± 12.5)歲;女性10例,平均年齡(67 ± 11.2)歲。以上患者均無家族性遺傳病史,檢查無其他部位原發(fā)腫瘤。本研究通過科學(xué)研究倫理委員會批準,并遵守患者知情同意原則。

1.3 主要試劑與儀器

RNA提取試劑Trizol購自Invitrogen公司(英國);反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Takara公司(日本);熒光定量PCR試劑購自康潤生物(中國);實驗所用定量引物由本實驗室設(shè)計(具體序列見表1),奧科鼎盛生物科技有限公司(中國,楊凌)合成。實驗所用實時熒光定量PCR儀Cobas Z480購自Roche公司(美國)。

表1 實時熒光定量PCR引物序列

1.4 總RNA的提取及cDNA的合成

取各組織樣品于研缽中,加入液氮研磨后,Trizol裂解法提取各腫瘤及其配對癌旁組織細胞的總RNA。核酸微量檢測儀檢測RNA樣品合格后,取1 μg總RNA,用反轉(zhuǎn)錄試劑盒按說明書用隨機引物反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1.5 實時熒光定量PCR分析LINC00519的表達

取各樣本反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA，按說明書用2×RealStar Green Fast Mixture試劑盒配制定量反應(yīng)體系,以U6位內(nèi)參基因，癌旁正常組織樣本為對照樣品，在實時熒光定量PCR儀上檢測LINC00519基因的相對表達。qPCR反應(yīng)條件為：95 ℃ 3 min，(95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s)×40 cycles，95 ℃ 5 s(60 ℃ 1 min,持續(xù)升溫至95 ℃,熒光檢測間隔為5 ℃)。實驗重復(fù)三次，LINC00519的表達量用2-ΔΔCt表示。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

用prism7.0對數(shù)據(jù)進行分析,兩組數(shù)據(jù)采用非參數(shù)Mann-Whitney檢驗,統(tǒng)計量用Mann-WhitneyU表示;多組數(shù)據(jù)采用Kruskal-Wallis進行分析,統(tǒng)計量用Kruskal-Wallis statistic表示。P<0.05為結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 LINC00519在不同腫瘤患者組織中的表達情況

利用在線軟件GEPIA對TCGA數(shù)據(jù)庫中不同腫瘤患者實體瘤及配對組織表達譜檢測結(jié)果進行分析,結(jié)果見圖1。LNC00519在睪丸癌、子宮內(nèi)膜癌和子宮癌中呈低表達狀態(tài);在膽癌、淋巴癌、頭頸部鱗癌、低級別膠質(zhì)癌、肺磷狀細胞癌、胰腺癌和胃癌組織中呈高表達狀態(tài);在結(jié)腸癌、食管癌、直腸癌、甲狀腺癌等組織中無明顯變化。LINC00519的表達可能存在組織特異性,不同組織中LINC00519的表達變化對腫瘤發(fā)生、發(fā)生發(fā)展的調(diào)節(jié)作用可能存在差異。在胃癌組織中,LINC00519表達較癌旁組織高,提示LINC00519可能具有促進胃癌發(fā)生和發(fā)展的作用。

ACC:腺樣囊性癌;BLCA:膀胱癌;BRCA:乳腺癌;CESC:宮頸鱗癌和腺癌;CHOL:膽管癌;COAD:結(jié)直腸癌;DLBC:彌漫性大B細胞淋巴瘤;ESCA:食管癌;GBM:膠質(zhì)母細胞瘤;HNSC:頭頸鱗狀細胞癌;KICH:腎嫌色細胞癌;KIRC:腎透明細胞癌;KIRP:乳頭狀腎細胞癌;LAML:急性髓細胞樣白血病;LGG:腦膠質(zhì)瘤;LIHC:肝癌;LUAD:肺腺癌;LUSC:肺鱗狀細胞癌;OV:卵巢癌;PAAD:胰腺癌;PCPG:腎上腺癌;PRAD:前列腺癌;READ:直腸腺癌;SARC:軟組織癌;SKCM:皮膚癌;STAD:胃癌;TGCT:睪丸癌;THCA:甲狀腺癌;THYM:胸腺癌;UCEC:子宮內(nèi)膜癌;UCS:子宮癌圖1 Oncolnc分析LINC00519在不同癌癥類型患者組織及其配對癌旁正常組織中的表達變化Figure 1 Oncolnc analysis of LINC00519 expression in patients with different tumors and paired normal adjacent tissues

2.2 LINC00519表達量與胃癌患者生存期的相關(guān)性分析

為進一步探究LINC00519表達量與胃癌發(fā)生發(fā)展間的關(guān)系,研究利用在線軟件GEPIA分析了胃癌患者腫瘤組織中LINC00519表達量與患者總生存期的關(guān)系。低LINC00519表達的胃癌患者相對于高LINC00519表達的胃癌患者具有較高的總生存期(見圖2)。該結(jié)果提示:LINC00519表達升高可能與胃癌的發(fā)展相關(guān)。

2.3 LINC00519在胃癌組織及其配對癌旁正常組織細胞中的表達

qPCR技術(shù)檢測20例胃癌和其配對的正常癌旁組織中LINC00519的表達情況,結(jié)果顯示:LINC00519在胃癌組織中的表達量顯著高于癌旁組織(差異倍數(shù)為2.187± 0.994 7,P=0.034 0,見圖3)。即,胃癌組織中LINC00519的表達量顯著高于正常癌旁組織。

2.4 LINC00519表達水平與胃癌臨床病理參數(shù)的相關(guān)性

LINC00519表達水平與胃癌臨床病理參數(shù)相關(guān)性分析結(jié)果見表2。LINC00519在不同性別胃癌患者中的表達無明顯差異(P>0.05);LINC00519在不同年齡段患者中的表達量無明顯差異(P>0.05);LINC00519的表達量在不同胃癌患者的臨床分期中無明顯差異(P>0.05);LINC00519在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中的表達量顯著高于未轉(zhuǎn)移患者(P<0.05)。

不同顏色虛線表示組內(nèi)不同觀察點存活患者人數(shù)和總?cè)藬?shù)，相當于擬合生存曲線的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)圖2 Oncolnc分析不同LINC00519表達量與胃癌患者總生存期的關(guān)系Figure 2 Oncolnc overall survival analysis for gastric cancer patients with different LINC00519 expression levels

圖3 LINC00519在胃癌組織中的表達情況Figure 3 LINC00519 expression changes in different gastric cancer tissues and paired normal adjacent tissues

表2 胃癌細胞中LINC00519表達水平與其臨床病理參數(shù)的相關(guān)性分析

3 討論

自1997年Wu等[7]探究胃腺癌印記丟失引起H19基因表達異常以來,已有大約135個長鏈非編碼RNA被發(fā)現(xiàn)在胃癌發(fā)生發(fā)展過程中異常表達[8]。在腫瘤發(fā)生過程中,長鏈非編碼RNA既可以作為致癌物也可以作為腫瘤抑制因子起作用。例如,HOTAIR(HOX Transcript Antisense RNA)被認為具有致癌作用,其表達量多少與胃癌的發(fā)生、發(fā)展及與預(yù)后密切相關(guān),可能作為胃癌診斷和預(yù)后檢測的靶基因[9-11]:胃癌組織中HOTAIR的表達量顯著高于癌旁組織;患者腫瘤組織中HOTAIR表達量越高,生存時間越短;提高HOTAIR的表達量能夠增強胃癌細胞的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血管侵襲能力,降低HOTAIR的表達量則可抑制表皮細胞向間質(zhì)細胞的轉(zhuǎn)化。與HOTAIR在胃癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用相反,長鏈非編碼RNA GAS5被認為能夠抑制胃癌的形成:GAS5被證明在胃癌組織中的表達量顯著低于正常組織,靶向GAS5基因表達量的提高可能提高胃癌治療效果[12-14],即GAS5基因的表達與患者腫瘤組織大小、耐藥性和預(yù)后相關(guān),GAS5基因表達量越低,患者腫瘤組織的體積越大、侵襲遷移能力越強、預(yù)后越差;過表達GAS5能夠降低胃癌細胞的耐藥性,使胃癌細胞生長受阻滯進而發(fā)生死亡。目前,隨著研究的進展,人們發(fā)現(xiàn)長鏈非編碼RNA的表達具有疾病或發(fā)育特異性,其表達變化可作為疾病或發(fā)育的潛在標志物。然而,胃癌發(fā)病原因復(fù)雜,受遺傳和環(huán)境等多種因素的影響,單基因的檢測或診斷常不能滿足臨床診斷、治療需求。截至目前,還未見HOTAIR或GAS5等基因單獨用于臨床胃癌檢測、診斷和治療的報道。為此,更多胃癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)長鏈非編碼RNA及其功能還有待進一步研究。

前期研究中,我們通過TCGA數(shù)據(jù)庫長鏈非編碼RNA表達譜的篩選發(fā)現(xiàn)LINC00519在包括胃癌在內(nèi)的多種腫瘤組織中的表達比癌旁組織高,同時,較高LINC00519表達量的胃癌患者生存期較LINC00519表達量低的患者短(見圖1,2)。然而,截至目前還未見LINC00519與腫瘤發(fā)生發(fā)展之間關(guān)系的相關(guān)報道。本研究中,我們通過20例胃癌患者腫瘤組織及其配對癌旁組織中LINC00519的定量PCR檢測證實:LINC00519在胃癌組織中的表達量較癌旁組織高,該結(jié)果與TCGA數(shù)據(jù)庫中LINC00519在胃癌組織中表達變化的結(jié)果一致。該結(jié)果提示LINC00519表達表達量的增加可能與胃癌的發(fā)生相關(guān)。此外,研究中我們通LINC00519表達量與胃癌患者臨床病理參數(shù)的統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn),LINC00519表達量的變化與胃癌患者的年齡、性別、臨床分期無明顯相關(guān)性,但相對于未發(fā)生淋巴結(jié)的胃癌患者,發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者其胃癌組織中LINC00519的表達量相對較高,這提示LINC00519表達量的增加可能在胃癌細胞的遠端轉(zhuǎn)移過程中具有重要意義。

綜上,本研究通過TCGA數(shù)據(jù)庫及20例胃癌患者胃癌組織及配對癌旁組織中LINC00519表達量的檢測證實:LINC00519在胃癌組織中的表達量較癌旁組織高,可能與胃癌的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。