朱振玲,張 敏,王夢(mèng)月,李曉波*

(1大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院中藥實(shí)驗(yàn)室,大理 671000;2上海交通大學(xué)藥學(xué)院中藥基因組學(xué)實(shí)驗(yàn)室;*通訊作者,E-mail:xbli@sjtu.edu.cn)

中藥肉桂為樟科植物肉桂(CinnamomumcassiaPresl)的干燥樹皮,具有補(bǔ)火助陽、散寒止痛、溫經(jīng)通脈、引火歸元的功效[1,2]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究證明肉桂具有鎮(zhèn)痛、抗菌、抗腫瘤的作用,對(duì)消化系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)疾病亦具有良好的療效[3-5]。從秦漢至今,肉桂產(chǎn)地基本集中在廣西、廣東和越南三個(gè)地方[6],廣西是國產(chǎn)肉桂藥材的原產(chǎn)地和最大的產(chǎn)區(qū),其種植面積和產(chǎn)量占全國的50%以上,其中玉林、平南、防城和岑溪肉桂藥材種植面積在30-40萬畝[7]。傳統(tǒng)道地藥材多為野生,近年來,因肉桂為藥食同源,多以農(nóng)副產(chǎn)品進(jìn)行流通,需求量大,野生產(chǎn)量不足以滿足需求,傳統(tǒng)產(chǎn)區(qū)出產(chǎn)的肉桂未明確分級(jí)要求,因此對(duì)其不同產(chǎn)地藥材進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)是肉桂藥材亟需解決及開展的研究之一。研究證明肉桂藥材的主要活性成分是揮發(fā)油,而揮發(fā)油中主要成分為桂皮醛和肉桂酸[8],桂皮醛含量是2015年版《中國藥典》肉桂含量測定項(xiàng)下規(guī)定的指標(biāo),而對(duì)于肉桂酸尚無標(biāo)準(zhǔn),目前肉桂酸含量的分析方法包括單掃描示波級(jí)譜法[9],傳統(tǒng)的液相色譜法[10,11],但對(duì)其進(jìn)行品質(zhì)相關(guān)性研究較少。本研究采用超高效液相色譜建立了肉桂酸活性成分快速測定方法,方法簡便、快速、靈敏、準(zhǔn)確。同時(shí)參照2015年版《中華人民共和國藥典》一部肉桂藥材檢測項(xiàng)下要求,結(jié)合聚類分析對(duì)收集自廣西多個(gè)產(chǎn)地的15批次肉桂藥材進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)。

1 材料

1.1 儀器與試劑

Agilent 1290 Infinity超高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)進(jìn)行定性、定量分析,包含在線脫氣器、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、光學(xué)二極管陣列檢測器;Agilent Proshell 120 EC-C18色譜柱(100 mm×4.6 mm,2.7 μm,Agilent Corporation,USA);瑞士卡瑪薄層數(shù)碼成像系統(tǒng);硅膠板HSGF254(煙臺(tái)江友硅膠開發(fā)有限公司);索氏提取器;電子天平(BT1250,北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司);SK6200H超聲清洗器(上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司)。

甲醇、乙醇、石油醚、乙酸乙酯、二硝基苯肼乙醇均為分析純(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司),乙腈為色譜純(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司),水為超純水,桂皮醛對(duì)照品(中國食品藥品檢定研究院,批號(hào)為110710-201720,純度均≥98% ),肉桂酸對(duì)照品(中國食品藥品檢定研究院,批號(hào)為110786-201604,純度均≥98% )。

1.2 樣本

從廣西平南、防城、玉林、梧州(芩溪和藤縣)等地共收集15批次肉桂藥材,外表面灰棕色,燒粗糙,具不規(guī)則細(xì)皺紋和橫向凸起皮孔,內(nèi)表面紅棕色,劃之有油痕。質(zhì)硬,脆,斷面不平坦,外層棕色較粗糙,內(nèi)層紅棕色而油潤,兩層間有一條黃棕色線紋。氣香濃烈,味甜,辣。經(jīng)上海交通大學(xué)李曉波教授鑒定為肉桂藥材(CinnamomumcassiaPresl)的干燥樹皮。肉桂藥材樣品編號(hào)及采集地(見表1和圖1)。

表1 15批次廣西肉桂藥材樣品信息

圖1 廣西肉桂藥材采集地Figure 1 Collection regions of Cinnamomi cassia in Guangxi

2 方法與結(jié)果

2.1 TLC鑒定

按照2015年版《中國藥典》一部肉桂藥材薄層測定法[1]。取本品粉末0.5 g,加甲醇冷浸20 min,取濾液作為供試品溶液。以石油醚-乙酸乙酯(17 ∶3)為展開劑,精密吸取15批肉桂藥材供試品溶液、桂皮醛對(duì)照品溶液各2 μl,采用瑞士卡瑪全自動(dòng)點(diǎn)樣儀和薄層數(shù)碼成像系統(tǒng)進(jìn)行薄層分析,使供試品在與對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上,顯相同顏色的斑點(diǎn),結(jié)果見圖2。編號(hào)1-15供試品在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上,顯相同顏色的黃色斑點(diǎn),表明肉桂藥材樣品中確系存在桂皮醛有效成分,達(dá)到藥典標(biāo)準(zhǔn)。

2.2 肉桂藥材水分和總灰分測定

2.2.1 肉桂藥材水分 按照2015年版《中國藥典》通則0832水分測定法項(xiàng)下的甲苯法[1]測定,平行試驗(yàn)2次,結(jié)果見表2。15批不同產(chǎn)地肉桂藥材的水分均小于15.0%,達(dá)到藥典標(biāo)準(zhǔn)。

2.2.2 肉桂藥材總灰分 按照2015年版《中國藥典》通則2302灰分測定法項(xiàng)下的總灰分測定法[1]測定,平行試驗(yàn)2次,結(jié)果見表2。15批不同產(chǎn)地肉桂藥材的灰分均小于5.0%,達(dá)到藥典標(biāo)準(zhǔn)。

R1.桂皮醛對(duì)照品;1-15.不同產(chǎn)地肉桂藥材,詳細(xì)信息見表1;1-6.收集自廣西平南;7,9,10.收集自廣西梧州；8.收集自廣西防城；11-15.收集自廣西玉林圖2 15批次廣西肉桂藥材薄層色譜圖(可見光下)Figure 2 Thin layer chromatography of 15 batches of Cinnamomi cassia in Guangxi under visible light

2.3 揮發(fā)油和桂皮醛含量測定

2.3.1 揮發(fā)油測定 按照2015年版《中國藥典》通則2204揮發(fā)油測定法項(xiàng)下的乙法[1]測定,平行試驗(yàn)2次,結(jié)果見表3。15批肉桂藥材揮發(fā)油含量分布在2.2-3.9 ml/g,均大于1.2 ml/g,表明15批肉桂藥材揮發(fā)油含量合格。由表4可知,廣西平南地區(qū)揮發(fā)油含量平均值為(3.8 ± 8.0)ml/g,廣西玉林地區(qū)揮發(fā)油含量平均值為(2.4 ± 1.5)ml/g。結(jié)果表明以揮發(fā)油為評(píng)價(jià)指標(biāo),廣西平南產(chǎn)肉桂藥材質(zhì)量為佳,但相同產(chǎn)地之間的肉桂藥材揮發(fā)油含量也有較大差異。

表2 15批次廣西不同產(chǎn)地肉桂藥材水分、總灰分含量(n=2)

表3 15批次廣西不同產(chǎn)地肉桂藥材揮發(fā)油、桂皮醛、肉桂酸含量 (n=4)

2.3.2 桂皮醛測定 按照2015年版《中國藥典》一部肉桂藥材含量測定法[1]測定。平行試驗(yàn)2次,每次試驗(yàn)進(jìn)樣2次,結(jié)果見表3。15批次肉桂藥材按干燥品計(jì)算,桂皮醛含量分布在23.19-45.11 mg/g,均大于15 mg/g,結(jié)果表明15批肉桂藥材桂皮醛含量符合藥典規(guī)定。由表4可知,廣西平南地區(qū)桂皮醛含量平均值為(37.05 ± 0.78)mg/g,廣西玉林地區(qū)桂皮醛含量平均值為(25.47 ± 0.38)mg/g。結(jié)果表明以桂皮醛含量為評(píng)價(jià)指標(biāo),廣西平南產(chǎn)肉桂藥材質(zhì)量為佳,但相同產(chǎn)地之間的肉桂藥材桂皮醛含量也有較大差異。

表4 15批次廣西相同產(chǎn)地肉桂藥材揮發(fā)油、桂皮醛和肉桂酸含量

2.4 肉桂酸含量測定

2.4.1 色譜條件 采用Agilent 1290 Infinity超高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)進(jìn)行定性、定量分析,它包含在線脫氣器、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、光學(xué)二極管陣列檢測器。采用Agilent Proshell 120 EC-C18色譜柱(100 mm×4.6 mm,2.7 μm,Agilent Corporation,USA)。進(jìn)樣量5 μl,柱溫30 ℃,體積流量0.5 ml/min,檢測波長276 nm,流動(dòng)相為乙腈(A)和1 mmol/L醋酸銨緩沖溶液(B),梯度洗脫條件為0-6 min,7% -26% A,6 -26 min,26% A,26 -30 min,32% A,30 -40 min,32% -90% A,40 -44 min,90% A。在上述色譜條件下,肉桂酸色譜峰能夠達(dá)到基線分離,肉桂藥材樣品色譜見圖3。

4月26日，奔赴阿斯特拉罕途中第2個(gè)參觀點(diǎn)是伏爾加河渡口。我們先后到離查干阿姆不足2—3公里的兩個(gè)渡口走訪。

2.4.2 溶液的制備 供試品溶液的制備:取肉桂藥材1.5 g,精密稱定,置100 ml圓底燒瓶中,精密加入純水50 ml,稱定重量,冷浸30 min,加熱回流40 min,放冷,再稱定重量,用純水補(bǔ)足減失的重量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液用0.22 μm濾膜濾過,即得。

對(duì)照品溶液的制備:精密稱取肉桂酸對(duì)照品適量,加甲醇定容至2 ml容量瓶中,濃度分別為0.002,0.010,0.050,0.250,0.500 mg/ml。

2.4.3 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.4.2”項(xiàng)下肉桂酸對(duì)照品溶液,依法進(jìn)樣,以峰面積(y)為縱坐標(biāo),進(jìn)樣量(x)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得回歸方程y=55 644x+125.86,r=0.999 5。結(jié)果表明，肉桂酸在0.002-0.500 mg/ml濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.4.4 精密度試驗(yàn) 取肉桂酸對(duì)照品溶液5 μl,按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件測定6次,記錄峰面積。結(jié)果峰面積RSD為1.60%,表明該儀器精密度良好。

2.4.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液,分別于室溫條件下放置0,2,4,6,8,10,12,24 h后,按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件測定,記錄峰面積。結(jié)果峰面積RSD為1.66%,表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

圖3 肉桂藥材供試品溶液色譜圖Figure 3 UPLC chromatogram of Cinnamomi Cassia samples

2.4.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取樣品溶液,按“2.4.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液,按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件測定。結(jié)果峰面積RSD為0.70%,表明方法重復(fù)性良好。

表5 肉桂酸加樣回收率 (n=3)

2.4.8 樣品含量測定 按“2.4.2”項(xiàng)下供試品溶液的制備,依法測定,計(jì)算藥材中肉桂酸含量。結(jié)果見表3。15批次肉桂藥材中肉桂酸含量為1.62-2.81 mg/g。由表4可知,廣西平南地區(qū)肉桂酸含量平均值為(2.38 ± 0.01)mg/g,廣西玉林地區(qū)桂皮醛含量平均值為(1.78 ± 0.01)mg/g。結(jié)果表明以肉桂酸含量為評(píng)價(jià)指標(biāo),廣西平南產(chǎn)肉桂藥材質(zhì)量為佳,但相同產(chǎn)地之間的肉桂藥材肉桂酸含量也有較大差異。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

為了探究肉桂藥材品質(zhì)與產(chǎn)地之間的關(guān)系,以水分、總灰分、揮發(fā)油含量、桂皮醛含量和肉桂酸含量作為描述樣品化學(xué)特征的變量。采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)15批肉桂藥材進(jìn)行聚類分析,綜合評(píng)判種植地區(qū)對(duì)肉桂藥材品質(zhì)劃分的影響。2.3項(xiàng)下檢測結(jié)果顯示,廣西肉桂藥材相同產(chǎn)地和不同產(chǎn)地之間揮發(fā)油、桂皮醛和肉桂酸含量差異較大。聚類分析結(jié)果見圖4,當(dāng)分類聚類為20時(shí),可將15批肉桂藥材樣品可聚為兩大類,即編號(hào)1-10(平南、梧州和防城)肉桂藥材之間的距離較小,質(zhì)量相似,聚為一類；編號(hào)11-15(玉林)為一類。

1-10.平南、梧州和防城肉桂藥材;11-15.玉林肉桂藥材圖4 15批次廣西產(chǎn)肉桂樣品的聚類分析Figure 4 Cluster analysis of 15 batches of Cinnamomum cassia samples in Guangxi

藥用植物次生代謝物是中藥治療疾病的重要物質(zhì)基礎(chǔ)[12],次生代謝物的合成積累對(duì)生長環(huán)境的依賴性很強(qiáng),其種類和含量因地域、氣候的不同有較大的差異[13]。肉桂藥材在不同的生長環(huán)境下,會(huì)導(dǎo)致次生代謝物的累積不同,出現(xiàn)肉桂藥材品質(zhì)優(yōu)劣的現(xiàn)象。由圖1廣西地圖可知,平南和梧州位于廣西東北部;防城位于廣西西部;而玉林位于廣西南部,這三個(gè)地域出產(chǎn)的肉桂藥材質(zhì)量差異較大,表明肉桂藥材質(zhì)量與地域有較大相關(guān)性。

3 討論

3.1 肉桂酸含量測定流動(dòng)相選擇

以各色譜峰分離度、峰形、出峰時(shí)間為指標(biāo),本試驗(yàn)探索性研究曾比較乙腈-水,乙腈-0.1%甲酸水溶液,乙腈-0.1%磷酸水溶液和乙腈-1 mmol/L醋酸銨緩沖液,但從總的分析結(jié)果中發(fā)現(xiàn),以乙腈-1 mmol/L醋酸銨緩沖液為流動(dòng)相時(shí),色譜峰分離良好,峰形較好,基線平穩(wěn)。

3.2 肉桂藥材品質(zhì)分析

2015年版《中國藥典》將桂皮醛作為肉桂藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn),而肉桂酸作為揮發(fā)油中主要的成分,具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等藥理作用[4],故本文添加肉桂酸作為肉桂藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)。

不同的生態(tài)系統(tǒng)所孕育出物質(zhì)的品質(zhì)各不相同,影響肉桂藥材品質(zhì)因素從環(huán)境角度分析,主要包括溫度、水分、光照和土壤成分,四者皆可影響其生長、次生代謝產(chǎn)物的合成與積累[14]。本實(shí)驗(yàn)以評(píng)價(jià)肉桂藥材質(zhì)量為研究目的,從TLC鑒定、水分、總灰分、揮發(fā)油含量、桂皮醛含量和肉桂酸等方面對(duì)肉桂藥材的質(zhì)量進(jìn)行綜合分析。肉桂屬偏陰樹種,特別幼年樹不耐強(qiáng)光,要求氣候溫暖,土層深厚,土質(zhì)疏松、濕潤、排水良好、酸性沙質(zhì)壤土栽培[15]。由圖1可知,廣西平南縣位于西江流域,該地域出產(chǎn)的肉桂又稱“西江桂”,質(zhì)量上乘,因此在中國屬廣西的“西江桂”最出名[16]。據(jù)報(bào)道,廣西平南縣靠北回歸線,日照足,雨量多,夏不酷熱,冬無嚴(yán)寒,年均溫度21.2 ℃,屬于海拔為50-500 m的亞熱帶地區(qū),山上土質(zhì)肥沃疏松,最宜肉桂生長,所產(chǎn)肉桂藥材的桂皮醛和肉桂酸等有效成分的含量都較高[17,18]。

表4結(jié)果顯示,相同產(chǎn)地肉桂藥材桂皮醛含量和肉桂酸含量也有一定的差距,因此本研究將采用聚類分析對(duì)不同產(chǎn)地和相同產(chǎn)地之間質(zhì)量評(píng)價(jià)做進(jìn)一步探討。

3.3 產(chǎn)地綜合質(zhì)量評(píng)價(jià)

聚類分析作為多變量統(tǒng)計(jì)技術(shù),在傳統(tǒng)中藥真假鑒別、種屬產(chǎn)地分類和質(zhì)量控制等領(lǐng)域得到較廣的應(yīng)用。采用SPSS軟件對(duì)廣西肉桂藥材種質(zhì)資源進(jìn)行聚類分析,以水分、灰分、揮發(fā)油含量、桂皮醛含量和肉桂酸含量作為聚類分析依據(jù),結(jié)果顯示15批肉桂藥材可按產(chǎn)地分為兩個(gè)類群,表現(xiàn)出其與地理來源存在一定的關(guān)聯(lián)性。

廣西東北部的平南、梧州(藤縣、岑溪)和西南部防城聚為Ⅰ類,其肉桂藥材品質(zhì)具有高度相似性且品質(zhì)較好,廣西南部玉林市聚為……類,其肉桂藥材品質(zhì)較差。據(jù)報(bào)道,平南、梧州和防城屬于亞熱帶地區(qū),全年氣候溫和;玉林屬于熱帶地區(qū),但在極端氣候時(shí)氣溫可達(dá)到最低溫-2 ℃,最高溫38.4 ℃,表明產(chǎn)地對(duì)肉桂藥材質(zhì)量有一定的影響。其中Ⅰ類又可細(xì)分成三小類:廣西平南等地區(qū)聚成質(zhì)量最好的小類,廣西防城和梧州(岑溪和藤縣)等地區(qū)聚成質(zhì)量稍差的另外兩小類,該分類符合地域分布特征。但廣西平南縣個(gè)別地區(qū)與防城市地區(qū)聚成一類,這也說明除不同分布區(qū)地域影響外,造成同一分布區(qū)質(zhì)量差異還可能與當(dāng)?shù)貧鉁?、雨量、土質(zhì)、生長狀況、種植地的海拔高度等諸因素密切相關(guān)。中藥品質(zhì)的形成是植物遺傳和環(huán)境因素雙重疊加作用的結(jié)果,需要對(duì)肉桂資源進(jìn)行進(jìn)一步跟蹤調(diào)查研究。

3.4 展望

本研究建立肉桂藥材中肉桂酸的超高效液相色譜(UPLC-DAD)測定方法,同時(shí)參照2015年版《中國藥典》一部中薄層鑒定、檢查和含量測定檢測要求,并結(jié)合聚類分析對(duì)廣西不同產(chǎn)地15批肉桂藥材進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示廣西地區(qū)肉桂藥材質(zhì)量均達(dá)到藥典標(biāo)準(zhǔn),其中廣西平南地區(qū)的肉桂藥材品質(zhì)最好;以水分、灰分、揮發(fā)油含量、桂皮醛含量和肉桂酸含量作為分類依據(jù),將15批肉桂藥材樣品按產(chǎn)地分為兩類,表明其質(zhì)量與地域有較大關(guān)聯(lián)性。結(jié)果表明,本研究可將廣西不同產(chǎn)地的肉桂藥材進(jìn)行區(qū)分,劃分了優(yōu)質(zhì)肉桂藥材生長的適宜區(qū),在一定程度上體現(xiàn)了肉桂資源的道地性,為肉桂資源的合理利用提供了有效的科學(xué)依據(jù)。同時(shí),不同產(chǎn)區(qū)的溫度、水分、光照、土壤等氣候條件對(duì)肉桂品質(zhì)有一定影響,因此當(dāng)考慮肉桂產(chǎn)區(qū)時(shí)應(yīng)充分考慮環(huán)境因素。