張志宏,李 鈞,王 丁,莊潤(rùn)濤

(1北京民航總醫(yī)院口腔科,北京 100123;2首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京口腔醫(yī)院;3北京交通大學(xué)社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心;*通訊作者,E-mail:15286928@qq.com)

由于較好的臨床效果,牙種植體通常代替一個(gè)或多個(gè)缺失牙齒的最佳治療方式[1,2]。與傳統(tǒng)的修復(fù)治療方案相比,牙種植體不僅具有較好的咬合功能,而且還具有更好的美學(xué)效果和較少的心理創(chuàng)傷[3,4]。盡管牙種植體已顯示出高成功率,但也有研究報(bào)道在初始愈合期和維護(hù)期間偶有失敗的案例[5]。一項(xiàng)長(zhǎng)期研究的證據(jù)表明,牙種植體周圍炎的發(fā)生率在11.2% -47.1%之間,如果不治療,其中一些最終會(huì)種植失敗[6]。植入物失敗與病人的危險(xiǎn)因素有關(guān),如病人的全身狀況、致病菌、植入物的宏觀和微觀設(shè)計(jì)、吸煙、骨質(zhì)量、植入物的數(shù)量以及它們的分布[5,7,8]。有研究表明吸煙通常是牙種植失敗的最常見因素之一[9],為評(píng)估吸煙與牙種植體的關(guān)系對(duì)人頜骨來源成骨細(xì)胞體外礦化能力的影響,本實(shí)驗(yàn)擬通過對(duì)比分析吸煙環(huán)境下的人頜骨來源的成骨細(xì)胞增殖、礦化能力及其相關(guān)基因表達(dá)的變化,來評(píng)估吸煙環(huán)境下對(duì)人頜骨來源成骨細(xì)胞體外礦化能力的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

主要材料包括胎牛血清(杭州四季青公司,中國(guó))、α-MEM培養(yǎng)基(Gibco公司,美國(guó))、0.25%胰蛋白酶(Sigma公司,美國(guó))、青鏈霉素(Gibco公司,美國(guó))、葡萄糖(津北精細(xì)化工公司,中國(guó))、MTT粉(Sigma公司,美國(guó))、二甲基亞砜(Sigma公司,美國(guó))、PBS緩沖液、4%多聚甲醛(北京化工試劑公司)、破膜工作液:CHAPS(Sigma公司)、超純RNA提取試劑盒(CWbio公司)、HiFi-MMLV cDNA第一鏈合成試劑盒(CWbio公司)、UltraSYBR Mixture(With ROX)(CWbio公司)、DNase 1(CWbio公司)、5x RNA Loading Buffer(CWbio公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑配制

①堿性磷酸酶孵育液：2%β-甘油磷酸鈉2.5 ml，2%巴比妥鈉2.5 ml，2%氯化鈣4.5 ml，2%硫酸鎂0.2 ml蒸餾水0.3 ml依次混合后，pH值調(diào)為9.2-9.4。②2%硝酸鈷水溶液：硝酸鈷2 g，蒸餾水加至100 ml。③1%硫化銨水溶液：硫化銨1 ml，蒸餾水99 ml。

1.3 成骨細(xì)胞來源

在首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京口腔醫(yī)院和民航總醫(yī)院口腔科選擇30位健康并進(jìn)行牙種植的志愿者。所有骨屑樣本分別取自患者在牙種植手術(shù)過程中產(chǎn)生的骨屑，取骨部位都在下頜磨牙區(qū)，骨質(zhì)均為Ⅲ類。納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡為30-50歲；②身體健康，無傳染病、心臟病、吸煙、糖尿病等全身系統(tǒng)性疾病、無藥物過敏史；③無其他不良生活方式，如酗酒，接受核輻射等；④同意并接受本次臨床實(shí)驗(yàn)的患者。該研究已通過北京口腔醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 成骨細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及傳代 ①成骨細(xì)胞的分離：實(shí)驗(yàn)所需的成骨細(xì)胞來源于接受牙種植手術(shù)的健康人手術(shù)過程產(chǎn)生的骨屑，無菌條件下中分離出成骨細(xì)胞。②成骨細(xì)胞的培養(yǎng)：將種植手術(shù)過程中嚴(yán)格按照無菌原則取得的骨屑加入裝有5 ml PBS的離心管中搖勻，以1 100 r/min分離心6 min，棄去上清，加入3 ml PBS搖勻后再次以1 100 r/min離心6 min，棄去上清。加入3 ml培養(yǎng)基，以小滴管吹打混勻，置于6 cm培養(yǎng)皿中，輕輕平搖培養(yǎng)皿以使骨屑分散，沉淀1 min后，吸出培養(yǎng)基，置于37 ℃孵育箱中15 min，取出后加入3 ml α-MEM培養(yǎng)基(含有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素100 mg/ml鏈霉素)，放入孵育箱中培養(yǎng)。約10 d左右待細(xì)胞自骨屑中爬出，更換培養(yǎng)基，之后依據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，每2 -3 d更換培養(yǎng)基，當(dāng)成骨細(xì)胞匯合至80%時(shí)，PBS清洗兩次，0.25%胰酶(pH=6.4)消化傳代，相差倒置顯微鏡觀察并照相。③成骨細(xì)胞的傳代：當(dāng)原代細(xì)胞匯合達(dá)80%時(shí)，PBS沖洗兩次，用0.25%胰酶胰酶(pH=6.4)約2 ml消化1-2 min，加入等量的α-MEM培養(yǎng)基終止消化，反復(fù)吹打后將細(xì)胞懸液移入離心管，1 100 r/min,離心6 min，棄上清。加入α-MEM培養(yǎng)基(含有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 mg/ml鏈霉素)重懸細(xì)胞，1 ∶3的比例傳代培養(yǎng)，待細(xì)胞再次匯合至80%時(shí)傳代。

1.4.2 實(shí)驗(yàn)分組 本次研究分為三組進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn),分別為低濃度香煙煙霧提取物(cigarette smoke extract,CSE)組、高濃度CSE組和健康對(duì)照組。CSE濃度制作見實(shí)驗(yàn)方法1.4.3。

1.4.3 CSE準(zhǔn)備 每支過濾嘴香煙包含0.1 mg尼古丁和1 mg焦油(KENT香煙,韓國(guó)),被用來制備煙霧提取物。CSE在通風(fēng)櫥中通過將橡皮管連接的支架上的煙霧冒泡到蠕動(dòng)泵來準(zhǔn)備。通過橡膠管將泵流出道連接到浸沒在磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中的玻璃吸管上。試驗(yàn)過程中10只香煙燃燒的煙霧剛好飽和溶解在20 ml的PBS中,我們?cè)O(shè)定為100%CSE。通過與將1 ml含有100%CSE的PBS溶液與199 ml的PBS溶液混合獲得0.5%CSE的終濃度,與34 ml的PBS溶液混合獲得3%CSE的終濃度。在MTT增殖測(cè)定中我們采用0.5%和3%的最終溶液濃度。陰性對(duì)照提取物采用未點(diǎn)燃的香煙制備。將提取物分成等分試樣并-20 ℃儲(chǔ)存。

1.4.4 成骨細(xì)胞的增殖能力檢測(cè) MTT法檢測(cè)人頜骨來源成骨細(xì)胞的增殖能力,操作過程如下:將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于96孔板,待細(xì)胞貼壁后依實(shí)驗(yàn)組別不同分別給予不含有CSE、含有0.5%CSE及含有3%CSE的環(huán)境下培養(yǎng)。分別在培養(yǎng)后第1,3,5,7天,每孔各加入MTT溶液(5 mg/ml)20 μl并于37 ℃下孵育4 h。小心棄去培養(yǎng)液后每孔各加二甲基亞砜150 μl,混勻后在酶聯(lián)檢測(cè)儀上檢測(cè)490 nm處吸光度值(OD值),繪制生長(zhǎng)曲線。

1.4.5 成骨細(xì)胞的礦化能力檢測(cè) 堿性磷酸酶染色法檢測(cè)成骨細(xì)胞的礦化能力，操作過程如下：將細(xì)胞懸液滴入玻璃圓片的培養(yǎng)孔中，孵箱孵育培養(yǎng)。PBS沖洗及4%多聚甲醛室溫固定30 min。用破膜液處理細(xì)胞15 min，PBS沖洗。加入堿性磷酸酶孵育液于37 ℃恒溫箱孵育4-6 h，流水浸洗2 min，2%硝酸鈷水溶液作用5 min，流水浸洗2 min，1%硫化銨水溶液處理30 s。最后流水浸洗數(shù)分鐘，以甘油明膠封片拍照。

1.4.6 吸煙下的成骨細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)差異 為了進(jìn)一步比較CSE對(duì)成骨細(xì)胞的體外礦化能力影響,從RNA水平鑒定成骨相關(guān)基因的表達(dá),本研究選取ALP、COL-1和BSP基因進(jìn)行檢測(cè)。取細(xì)胞RNA并檢測(cè)其質(zhì)量,進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,熒光定量PCR采用BIO-RAD CFX96序列檢測(cè)系統(tǒng)來進(jìn)行。設(shè)置擴(kuò)增條件如下:95 ℃預(yù)變性3 min;95 ℃ 10 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 10 s共進(jìn)行40個(gè)循環(huán);最后72 ℃下延伸10 min。各待測(cè)樣品分別以內(nèi)參基因(GAPDH作為對(duì)照,同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照(不加模板),每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)3次,三次得到的Ct值結(jié)果平均值為最終測(cè)定結(jié)果。引物由南京凱基生物工程有限公司合成,引物序列見表1。

表1 目的基因的引物序列

2 結(jié)果

2.1 吸煙環(huán)境下對(duì)人頜骨來源成骨細(xì)胞增殖能力的影響

MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，高CSE組的成骨細(xì)胞增殖能力與低CSE組和對(duì)照組比較明顯降低。三組細(xì)胞都是從接種的第3天開始進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,第4-7天時(shí)均處于增殖旺盛期,從接種的第3天開始,一直到檢測(cè)的第7天,高CSE組頜骨來源成骨細(xì)胞的增殖能力均低于對(duì)照組和低CSE組(見圖1)。

圖1 MTT檢測(cè)三組成骨細(xì)胞的增殖Figure 1 Proliferation of osteoblasts in three groups by MTT

2.2 吸煙環(huán)境下對(duì)人頜骨來源成骨細(xì)胞礦化能力的影響

低CSE組與對(duì)照組相比堿性磷酸酶染色水平差異不明顯,這說明低CSE組與對(duì)照組的成骨細(xì)胞礦化能力差異不明顯;而與對(duì)照組相比,高CSE組的堿性磷酸酶水平明顯降低(見圖2)。

2.3 吸煙環(huán)境下對(duì)人頜骨來源成骨細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)

根據(jù)前面的結(jié)果已經(jīng)明確:一定濃度以上的CSE能夠影響人頜骨來源成骨細(xì)胞的增殖與礦化,那么它是怎樣影響這些過程的,是否對(duì)成骨細(xì)胞增殖與礦化的相關(guān)基因產(chǎn)生了影響。為解決這個(gè)問題,我們通過RT-PCR檢測(cè)了相關(guān)基因的表達(dá)。選取ALP、COL-1和BSP基因進(jìn)行分析,以GAPDH作為內(nèi)參進(jìn)行實(shí)驗(yàn),用2-ΔΔCt法進(jìn)行分析,檢測(cè)不同組中基因相對(duì)表達(dá)量的變化,結(jié)果見圖3。高CSE組與對(duì)照組的ALP、COL-1和BSP基因的相對(duì)表達(dá)量無明顯差異。而低CSE組人頜骨來源成骨細(xì)胞的ALP、COL-1和BSP基因表達(dá)低于對(duì)照組與高CSE組。

圖2 不同CSE濃度下堿性磷酸酶染色Figure 2 Alkaline phosphatase staining of human jawbone-derived osteoblasts after treated with different concentrations of CSE

與對(duì)照組和低CSE組比較，*P<0.05圖3 礦化基因在三組的相對(duì)基因表達(dá)量Figure 3 Expression of ALP，COL-1，and BSP in three groups

3 討論

香煙通常含有大約1.2-2 mg尼古丁,這取決于香煙的品牌以及是否存在過濾嘴。尼古丁是香煙煙霧的主要成分,吸煙已被證實(shí)與骨代謝和骨骼重塑的負(fù)面影響有關(guān)[10]。但是,尼古丁對(duì)培養(yǎng)的成骨細(xì)胞的影響仍有爭(zhēng)議,主要存在低劑量刺激效應(yīng)和高劑量負(fù)效應(yīng)的雙相效應(yīng)[11-13]。在一項(xiàng)使用MG-63人類成骨樣細(xì)胞系的研究中,Rothem等[14]證實(shí)了暴露于100 μm尼古丁的細(xì)胞中842個(gè)基因的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性變化,并檢測(cè)了低劑量尼古丁誘導(dǎo)的OC、I型膠原和ALP上調(diào)表達(dá)。另一項(xiàng)研究檢測(cè)了尼古丁對(duì)兔骨髓衍生的成骨樣細(xì)胞的成骨細(xì)胞活性的劑量依賴性正效應(yīng),并且表明尼古丁可能不是造成吸煙者中觀察到的骨愈合受損的原因[15]。同一組的先前研究也表明通過經(jīng)皮尼古丁貼片遞送的尼古丁顯著增強(qiáng)了兔子的后部脊柱融合率[16]。

盡管尼古丁是所有香煙煙霧顆粒相的主要成分,并且通過習(xí)慣性吸煙維持在身體組織中,但吸煙暴露與尼古丁暴露對(duì)骨骼的影響可能不同。Skott等[17]研究了尼古丁和不含尼古丁的煙草提取物單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用對(duì)大鼠股骨骨折模型中股骨閉合性骨折的機(jī)械強(qiáng)度的影響。當(dāng)機(jī)械測(cè)試骨折愈合時(shí),與煙堿組相比,煙草提取物組屈服點(diǎn)的極限扭矩和扭矩分別下降20%和26%。另外,與尼古丁組相比,在聯(lián)合組中觀察到屈服點(diǎn)扭矩減少18%。然而,在煙草提取物和聯(lián)合組之間沒有發(fā)現(xiàn)差異。另一項(xiàng)研究報(bào)道尼古丁可以作為骨細(xì)胞代謝活動(dòng)的直接興奮劑,煙霧凝聚物(含有相當(dāng)水平的尼古丁)在小鼠MC3T3-E1成骨細(xì)胞樣細(xì)胞中引起抑制作用[18]。這些結(jié)果表明吸煙,而不是只是暴露于尼古丁,可能是主要因素。

在本研究中,當(dāng)暴露于濃度等于0.5%的CSE時(shí),成骨細(xì)胞的存活力降低。我們同時(shí)也觀察到0.5%濃度的CSE對(duì)降低人頜骨來源成骨細(xì)胞的ALP、COL-1和BSP基因表達(dá),降低成骨細(xì)胞的活性和礦化。