符林瑜, 林 景,徐博譞

(海南省第五人民醫(yī)院藥劑科,?？?570206)

白色念珠菌是一種在臨床上常見的機會致病真菌,多于人體皮膚黏膜定植,在一定條件下如人體的微生態(tài)失衡或者免疫力受損時[1-3],則引發(fā)白色念珠菌快速繁殖,造成口腔、皮膚以及陰道等部位的感染甚至系統(tǒng)性感染[4-6]。據統(tǒng)計在院內獲得性感染中,由于念珠菌的感染所致的導管相關性感染居于第三位,血源性感染居于第四位[7,8],由于白色念珠菌所致的感染比重最大占45%左右,而即使使用了抗真菌類藥物仍有近乎40%的死亡率,說明該類真菌產生了極強的抗藥性[9]。對于抗藥性研究臨床得到的原因有多種,其中一個很主要的因素在于生物膜的形成[10]。生物膜指的是細菌或者真菌等微生物在其生存的生物或者是非生物組織的表面分泌多種基質,從而產生一層復雜三維結構[11-13],由此使菌體對于藥物的抗性比浮游菌大大增強。因而若能篩選得到新型藥物抑制或抵抗白色念珠菌生物膜的形成,則可以很好地解決耐藥性這一難題。

臨床上應用最廣的抗真菌藥物為氟康唑,臨床上發(fā)現對人和動物的真菌感染均有良好的廣譜抑制作用[14,15]。而長期的使用所引發(fā)的抗藥性也日益加劇,研究發(fā)現對于白色念珠菌抗藥性的出現,是因為在長期使用過程中白色念珠菌形成一層生物膜可有效抵抗氟康唑的作用[16,17]。本次研究所提出的大蒜素(garlicin)是一種從百合科植物大蒜的鱗莖中在大蒜酶的作用下將大蒜氨酸分解而提取得到的三硫代烯丙醚類的化合物,部分蔥的鱗莖中也有存在。在臨床上具有抗腫瘤、抗血小板凝集、防治肝纖維化的作用,而實驗室研究發(fā)現對多種革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、真菌、寄生蟲和病毒均有良好的抑制和抵抗作用。本次研究擬探討大蒜素對于白色念珠菌生物膜形成的抵抗作用,以期為臨床研究以及治療提供參考,現將結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 材料

菌株:白色念珠菌標準品SC5314,臨床菌株來自不同的10例病人。

藥物:大蒜素標準品(garlicin,西安小草植物科技有限公司),氟康唑(Fluconazole,FLC,中國食品藥品檢定研究院,批號100314-201204)。

試劑:PBS緩沖液(自制,pH 7.0 ± 2.0),XTT(BBI,加拿大),維生素K3(博美,中國),25%戊二醛溶液(國藥集團化學試劑有限公司,中國),RPMI-1640培養(yǎng)基(Gibco,美國),FUN1(Invitrogen,美國),總RNA提取試劑盒(TOYOBO,日本),PCR試劑(TOYOBO,日本)。

1.2 器材與軟件

器材:96孔板,6孔板(Corning),恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科技有限公司),多功能酶標儀(上海美谷分子儀器有限公司),熒光倒置顯微鏡(OLYMPUS),掃描電子顯微鏡(SEM),熒光定量PCR儀(ABI)。

軟件:Graphpad Prism 6.0,Image J,Oligo 7.0。

1.3 方法

1.3.1 配制菌懸液 挑取保存的YPD固體平板上的白色念珠菌標準菌株,接種到5 ml YPD培養(yǎng)液中,經過220 r/min 37 ℃活化12 h使其處于指數生長期,之后用RPMI-1640培養(yǎng)基對菌液進行調整使菌液終濃度為2×106CFU/ml。取濃度為2×106CFU/ml的白色念珠菌懸液再調整菌液濃度為2×103CFU/ml,100 μl接種至96孔板中,37 ℃培養(yǎng)24 h使白色念珠菌貼于板底并產生出生物膜。倒置顯微鏡下觀察確定生物膜的生成。之后收集生物膜備用。

1.3.2 分別檢測大蒜素與氟康唑對白色念珠菌的殺傷作用 將大蒜素和氟康唑進行濃度梯度的二倍倍比稀釋,稀釋范圍分別在4-2 048 μg/ml和0.125-1 024 μg/ml。每個濃度做3個復孔,另外設置1個只含有RPMI-1640的孔作為陰性對照。實驗時同樣將上述接種到96孔板中貼壁的白色念珠菌上清培養(yǎng)液吸棄,加入用培養(yǎng)液稀釋好的不同濃度的大蒜素以及氟康唑37 ℃孵育48 h,之后用預熱到60 ℃的培養(yǎng)液溶解XTT粉末為6.6 mmol/L加入20 μl到96孔板中培養(yǎng)2 h,之后通過多功能酶標儀在595 nm處測定吸光度值(OD)。從而計算每個樣品OD值占對照組OD值的比率,當加藥組的值等于陰性對照組的值時,所對應的最小藥物濃度即為MIC。

1.3.3 80%生物膜抑制濃度(SMIC80)測定 將XTT粉末溶于林格溶液配成0.5 g/L,維生素K3溶于丙酮儲存濃度配成10 mmol/L,二者均可置于-20 ℃儲存?zhèn)溆?。實驗時,XTT溶液與維生素K3溶液混合,使維生素K3終濃度為1 μmol/L。吸棄96孔板上清液(RPMI-1640培養(yǎng)基),用PBS洗一次后,每孔加入80 μl上述混合液,37 ℃避光孵育2.5 h。之后通過多功能酶標儀在595 nm處測定吸光度值(OD)。從而計算每個樣品OD值占對照組OD值的比率,該值為80%時則對應的樣品濃度即為SMIC80。以上均進行三次獨立重復實驗。

1.3.4 對標準菌株SC5314生物膜抑制率的檢測 實驗操作同“1.3.3”,同樣將菌接種在96孔板中37 ℃培養(yǎng)24 h保證生成生物膜,后加入終濃度為1 μmol/L的維生素K3溶液避光孵育2.5 h,通過酶標儀測定吸光度值。在最終統(tǒng)計數據結果時,生物膜抑制率=100-(OD樣品/OD對照)×100%。分別進行三次獨立重復試驗。

1.3.5 對標準菌株SC5314的時間-抑制曲線 分別加入2×106CFU/ml的菌液3 ml以及氟康唑溶液或者大蒜素溶液3 ml到試管中,其中氟康唑的濃度為256 μg/ml,大蒜素溶液濃度分別為0,32,64,128,256 μg/ml。于37 ℃分別培養(yǎng)1,2,4,12,24 h后,吸取100 μl用PBS進行10倍的倍比稀釋。再將原菌液和不同稀釋倍數的菌液分別吸取100 μl涂布到YPD固體平板上,倒置,37 ℃下培養(yǎng)48 h后進行菌落計數。菌落數在20個以上為陽性。之后畫出時間-抑制曲線。

1.3.6 白色念珠菌標準菌株SC5314生物膜厚度觀察 吸取2×106CFU/ml的菌液1 ml以及氟康唑溶液或者大蒜素溶液1 ml到六孔板中混勻,其中氟康唑的濃度為256 μg/ml,大蒜素溶液濃度分別為0,32,64,128,256 μg/ml。置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。之后用PBS清洗3次,加入FUNI熒光染料進行染色,避光,0.5 h后對生物膜厚度進行觀察統(tǒng)計。

1.3.7 白色念珠菌標準菌株SC5314相關基因qPCR檢測 使用試劑盒將用大蒜素128 μg/ml處理8 h后的菌株以及無大蒜素處理的菌株的總RNA提取,并進行逆轉錄,從而分析生物膜形成相關基因的表達情況。在NCBI基因庫查詢得到相關基因的序列后利用軟件Oligo 7.0設計引物,送至上海生工公司合成。相關基因及引物序列見表1。qPCR反應體系如下:上下游引物均為1 μl(10 μmol/L),2×SYBR Green Master Mix 12.5 μl,cDNA 0.5 μl,加RNase Free H2O補足到25 μl。設置條件為:95 ℃,15 s;55 ℃,15 s;72 ℃,45 s,將以上條件進行40個循環(huán)。

表1 白色念珠菌生物膜相關基因及引物序列

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 白色念珠菌的MIC與SMIC80

除了標準菌株SC5314以及臨床菌株4號,6號以外的菌株,對氟康唑的MIC均在128 μg/ml以上,定義為耐藥菌株,而所有菌株對于氟康唑的SMIC80均為1 024 μg/ml以上。而大蒜素對于所有白色念珠菌的MIC在32-128 μg/ml,SMIC80為64-256 μg/ml,均小于對應到氟康唑的作用值(見表2)。由此可見,大蒜素對白色念珠菌生物膜形成的抑制作用優(yōu)于氟康唑。

表2 白色念珠菌的MIC與SMIC80

2.2 大蒜素對標準菌株SC5314的生物膜抑制率

實驗結果顯示,大蒜素對于白色念珠菌標準株SC5314的生物膜形成呈現劑量依賴的抑制效果,當大蒜素濃度為4 μg/ml時對生物膜形成的抑制作用不明顯,隨著劑量的升高開始表現出抑制作用,而當大蒜素濃度升為128 μg/ml時,對生物膜形成的抑制作用達到80% ,顯著高于對照組(大蒜素濃度為0)(P<0.001,見圖1)。

與大蒜素濃度為0相比,*P<0.05,* *P<0.01,* * *P<0.001圖1 大蒜素對標準菌株SC5314的生物膜抑制率Figure 1 Biofilm inhibition rate of allicin against standard strain SC5314

2.3 大蒜素對標準菌株SC5314的時間-抑制曲線

當大蒜素的濃度為64 μg/ml及以下時,對于菌株的抑制作用不明顯(P>0.05),而當大蒜素的濃度升高到128 μg/ml時,對菌株的抑制作用表現明顯(P<0.01,見圖2),并且在第4小時時lgCFU降為4,由此可見,大蒜素有顯著的殺菌效果)。

與對照組相比,*P<0.05,* *P<0.01,* * *P<0.001圖2 對標準菌株SC5314的時間-抑制曲線Figure 2 Time-inhibition curve of allicin for the standard strain SC5314

2.4 白色念珠菌生物膜厚度觀察

通過對染色后的熒光強度進行量化,來顯示生物膜的厚度,可以發(fā)現,熒光強度隨著大蒜素的濃度升高而不斷降低,在大蒜素濃度為128 μg/ml時,熒光強度值接近于0(見圖3)。

2.5 白色念珠菌標準菌株SC5314相關基因表達情況

使用大蒜素128 μg/ml處理8 h后,與不加大蒜素處理相比,生物膜相關基因ALS1表達下調了4.7%,SUN41下調了18.7%,MP65下調了68.3%,HWP1下調了77.4%,GSH1下調了38.4%(見圖4)。

與大蒜素濃度為0相比,*P<0.05,* *P<0.01,* * *P<0.001圖3 白色念珠菌生物膜厚度觀察Figure 3 Candida albicans biofilm thickness after different treatment

圖4 大蒜素128 μg/ml處理8 h后白色念珠菌標準菌株SC5314相關基因表達情況Figure 4 Expression of related genes of Candida albicans SC5314 after 8 h treatment with allicin 128 μg/ml

3 討論

大蒜素是一種從百合科植物大蒜的鱗莖中提取得到的一種三硫代烯丙醚類的化合物,有研究顯示,該種分子對于多種細菌、真菌、寄生蟲、病毒等均具有良好的抑制作用[18-20]。而針對于白色念珠菌的抵抗作用尤其是抵抗生物膜形成的原理尚未見報道。

XTT是四唑氮的衍生物,可自由進入活細胞內,可在活細胞內的線粒體中琥珀酸脫氫酶作用下被還原為黃色的甲臢,通過DMSO將其溶解后測定吸光度值可以反映細胞活性。

本次研究發(fā)現,除了標準菌株SC5314以及臨床菌株4號,6號以外的菌株,對氟康唑的MIC均在128 μg/ml以上,定義為耐藥菌株,而所有菌株對于氟康唑的SMIC80均在1 024 μg/ml以上。而大蒜素對于所有白色念珠菌的MIC為32-128 μg/ml,SMIC80為64-256 μg/ml,均小于對應到氟康唑的作用值。由此可見,大蒜素對白色念珠菌生物膜形成的抑制作用優(yōu)于氟康唑;大蒜素對于白色念珠菌標準株SC5314的生物膜形成呈現劑量依賴的抑制效果,當大蒜素濃度為4 μg/ml時對生物膜形成的抑制作用不明顯,隨著劑量的升高開始表現出抑制作用,而當大蒜素濃度升為128 μg/ml時,對生物膜形成的抑制作用達到80%,顯著高于對照組(P<0.001);當大蒜素的濃度為16 μg/ml及以下時,對于菌株的抑制作用不明顯(P>0.05),而當大蒜素的濃度升高到128 μg/ml時,對菌株的抑制作用表現明顯(P<0.01),并且在第4小時時lgCFU降為4,由此可見,大蒜素有顯著的殺菌效果。

通過對染色后的熒光強度進行量化來顯示生物膜的厚度,可以發(fā)現,熒光強度隨著大蒜素的濃度升高而不斷降低,在大蒜素濃度為128 μg/ml時,熒光強度值接近于0。因而在大蒜素的作用下,白色念珠菌的生物膜厚度顯著降低。

對于生物膜形成的相關基因,HWP1基因控制黏附素蛋白的合成,該蛋白通過共價鍵可與宿主細胞進行集合,是第一個發(fā)現的在體內條件下顯著影響生物膜形成的基因,有研究顯示HWP1缺失的基因難以合成完整生物膜。SUN基因主要控制菌體細胞的細胞壁合成以及生物膜形成,有研究顯示SUN基因缺失菌株的生物膜無法合成,且致病性顯著受到影響。MP65基因主要控制細胞壁葡聚糖和黏附素的合成,研究顯示該基因缺失的菌株也無法合成有效生物膜[21]。ALS基因控制細胞壁表面糖蛋白的合成,有利于菌絲的形成。本次研究使用大蒜素處理白色念珠菌后,進行qPCR對生物膜形成相關基因表達情況進行測定,發(fā)現經過大蒜素處理后,生物膜相關基因ALS1表達下調了4.7%,SUN41下調了18.7%,MP65下調了68.3%,HWP1下調了77.4%,GSH下調了38.4%。由此可見,大蒜素主要通過下調與生物膜合成相關基因的表達來達到抑制生物膜合成的作用。

綜上所述,大蒜素對于白色念珠菌具有抑制作用,并對其表面生物膜的形成具有良好的抵抗作用,效果顯著,值得臨床參考。