樊新宇,夢 遙,盛長斌,何 朵,李 玲

(空軍軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)教研室,西安 710032;*通訊作者,E-mail:liling25@fmmu.edu.cn)

腫瘤干細(xì)胞理論認(rèn)為腫瘤組織中只有小部分腫瘤細(xì)胞具備形成腫瘤的能力[1];這部分腫瘤組織中為數(shù)不多、具有自我更新能力與分化潛能、能夠產(chǎn)生新的腫瘤的細(xì)胞,稱為腫瘤干細(xì)胞,又稱癌癥干細(xì)胞(cancer stem cells,CSCs)[2]。CSCs被認(rèn)為是腫瘤轉(zhuǎn)移和放化療失敗的根源,針對CSCs的腫瘤轉(zhuǎn)移耐藥機(jī)制研究是目前抗腫瘤治療的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。

研究CSCs的轉(zhuǎn)移耐藥機(jī)制首先需要分離鑒定CSCs。目前,分離鑒定方法或依據(jù)CSCs表面標(biāo)志物進(jìn)行流式或磁珠分選,或利用CSCs特性如耐藥特性、代謝特性以及腫瘤微球體形成能力等進(jìn)行篩選富集[3,4]。這其中,依據(jù)表面標(biāo)志物分選是最早和最常應(yīng)用的CSCs分離方法。乳腺癌是第一個通過細(xì)胞表面標(biāo)志物分離鑒定CSCs的實(shí)體腫瘤。2003年,Al-Hajj等[5]應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)分選出CD44+CD24-/low細(xì)胞亞群,并通過NOD/SCID小鼠成瘤實(shí)驗(yàn),確定CD44/CD24是乳腺癌CSCs表面標(biāo)志物。近年來,人們又陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了其他多種乳腺癌CSCs表面標(biāo)志物分子,如CD133、上皮細(xì)胞黏附分子(EpCAM)、CXCR4、CXCL1、CD29、CD49f、CD61、CD166、CD47等[6,7];這些標(biāo)志物均基于細(xì)胞表面抗原的表達(dá),進(jìn)而標(biāo)記特定細(xì)胞亞群。2007年,Ginestier等[8]報道了另一個乳腺癌CSCs標(biāo)志物ALDH1;該標(biāo)志分子位于細(xì)胞內(nèi),具有乙醛脫氫酶活性,其表達(dá)水平所受干擾因素的影響較少、相對穩(wěn)定,因此被認(rèn)為是乳腺癌CSCs最為可靠的標(biāo)志物,且其表達(dá)與腫瘤細(xì)胞治療反應(yīng)性、進(jìn)展表型及病人不良預(yù)后相關(guān)[9,10]。ALDH1不僅可以標(biāo)記乳腺癌CSCs,還可以標(biāo)記多種CSCs。目前,CD44/CD24與ALDH1都是公認(rèn)的乳腺癌干細(xì)胞標(biāo)志物,但是兩種標(biāo)志物之間的關(guān)系以及利用這兩種標(biāo)志物分離出的細(xì)胞群之間的關(guān)系都有待闡明。本研究擬通過流式細(xì)胞儀檢測技術(shù),分析乳腺癌細(xì)胞中CD44/CD24與ALDH1標(biāo)記的CD44+CD24-與ALDH1+兩種乳腺癌CSCs亞群的比例及其相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株

乳腺癌細(xì)胞系BT474、BT549、MDA-MB-453、MDA-MB-468、MDA-MB-231、SK-BR-3、MCF7、T-47D均購自中科院上海細(xì)胞所。所有細(xì)胞均經(jīng)過支原體檢測和短串聯(lián)重復(fù)序列(short tandem repeat,STR)分析鑒定。

1.2 乳腺癌轉(zhuǎn)移胸腔積液

收集經(jīng)細(xì)胞病理學(xué)確診的乳腺癌患者轉(zhuǎn)移胸腔積液標(biāo)本4例,分別標(biāo)記為BC-6,BC-8,BC-9L,BC-9R;其中,BC-9為左右側(cè)胸腔積液。4例胸腔積液標(biāo)本患者的臨床病理信息見表1。胸腔積液收集后迅速置于冰上,并于2 h內(nèi)處理。該研究得到空軍軍醫(yī)大學(xué)(西安,中國)倫理委員會的批準(zhǔn),并獲得了患者的知情同意。

1.3 主要試劑

RPMI-1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基(美國Life Technologies公司);胰島素(美國Sigma公司);胎牛血清(杭州四季青生物生物工程材料有限公司);EDTA與胰蛋白酶(美國Life Technologies公司);藻紅蛋白(PE)標(biāo)記的CD24抗體、藻紅蛋白(PE)標(biāo)記的同型抗體、別藻藍(lán)蛋白(APC)標(biāo)記的CD44抗體、別藻藍(lán)蛋白(APC)標(biāo)記的同型抗體(美國BD公司);ALDEFLOUR kit(加拿大Stem Cell公司)。

1.4 方法

分離培養(yǎng)乳腺癌細(xì)胞系和乳腺癌轉(zhuǎn)移胸腔積液細(xì)胞,進(jìn)行CD44/CD24與ALDH1的標(biāo)記染色,應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測CD44+CD24-與ALDH1+細(xì)胞亞群的比例,并分析兩種標(biāo)記物之間的相關(guān)性。

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng) 乳腺癌細(xì)胞系BT474、BT549與T-47D培養(yǎng)基為含10%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)的RPMI-1640培養(yǎng)基并添加0.2 U/ml胰島素,SK-BR-3、MDA-MB-453、MDA-MB-468、MDA-MB-231與MCF7培養(yǎng)基為含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基。細(xì)胞培養(yǎng)條件為37 ℃恒溫,通入5%CO2、95%空氣。

1.4.2 乳腺癌轉(zhuǎn)移胸腔積液細(xì)胞分離 將500 ml胸腔積液于530g、4 ℃離心5 min;去上清,細(xì)胞沉淀重懸于5-10 ml紅細(xì)胞溶解液(北京天根生物技術(shù)公司)以去除紅細(xì)胞;收集單個核細(xì)胞,用3份體積的平衡鹽溶液(Hank’ s balanced sale solution,HBSS)400g室溫離心洗滌兩次;最后,用2%FBS/HBSS與1 μg/ml 7-AAD(BD公司)重懸細(xì)胞,并進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.4.3 流式樣品制備 將乳腺癌細(xì)胞按8×105細(xì)胞/孔接種于6孔板,每個樣品接種3個復(fù)孔。24 h后用消化液消化,HBSS洗滌兩次,制成單細(xì)胞懸液,置于冰上進(jìn)行后續(xù)標(biāo)記。

1.4.3.1 CD44與CD24標(biāo)記 參照抗體使用說明書推薦濃度,分別設(shè)IgG2b-κ-APC+IgG2b-κ-PE、CD44-APC+IgG2b-κ-PE、CD24-PE+IgG2b-κ-APC、CD24-PE+CD44-APC四組。每組按1×106細(xì)胞各加入5 μl 7-AAD與上述抗體,冰上避光染色30 min;HBSS洗滌兩次后進(jìn)行流式檢測。

1.4.3.2 ALDH1標(biāo)記 參照ALDEFLUOR試劑盒的說明書進(jìn)行操作。用ALDEFLUOR Buffer重懸細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106細(xì)胞/ml,設(shè)空白對照組、單染7-AAD組、DEAB組、樣品組,分別加入5 μl的HBSS、7-AAD、DEAB+活化的BAAA、活化的BAAA,37 ℃孵育40 min;離心并用HBSS洗滌兩次,ALDEFLUOR Buffer重懸細(xì)胞,進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測。

1.4.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測與分析 通過BD公司FACS Calibur流式細(xì)胞儀對標(biāo)記樣品進(jìn)行檢測,以7-AAD圈門,每個樣品至少采集10 000個細(xì)胞;流式結(jié)果采用FlowJo7.6軟件進(jìn)行分析。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

除胸腔積液標(biāo)本外,細(xì)胞系分析檢測均重復(fù)3次以上。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,使用GraphPad Prism6.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析,相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)系數(shù)法,r>0.3表示為有相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 CD44+CD24-細(xì)胞亞群比例分析

流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn),8種乳腺癌細(xì)胞系CD44+CD24-細(xì)胞亞群的比例在不同細(xì)胞系波動較大,范圍在0.05%-90.8%之間;其中,MDA-MB-231細(xì)胞和BT-549細(xì)胞的CD44+CD24-細(xì)胞亞群比例分別為(90.80 ± 7.22)%和(86.95 ± 8.88)%;其余6種細(xì)胞的CD44+CD24-細(xì)胞亞群比例均≤5%(見圖1)。4例乳腺癌轉(zhuǎn)移胸腔積液中,CD44+CD24-細(xì)胞亞群的比例總體較高,有3例達(dá)到50%以上,另一例(BC-8)為5.54%。

2.2 ALDH1+細(xì)胞亞群比例分析

8種乳腺癌細(xì)胞系中,ALDH1+細(xì)胞亞群的比例總體較低,范圍在0.98%-25.2%之間(見圖2)。其中,CD44+CD24-細(xì)胞亞群比例最高的MDA-MB-231細(xì)胞其ALDH1+細(xì)胞亞群比例則最低,為(0.98 ± 0.61)%。4例乳腺癌轉(zhuǎn)移胸水中,ALDH1+細(xì)胞亞群的比例總體波動較大,范圍在4.04% -72.2%之間,有2例達(dá)到30%以上。

2.3 CD44+CD24-與ALDH1+兩種乳腺癌CSCs細(xì)胞亞群的相關(guān)性

對CD44+CD24-與ALDH1+兩種細(xì)胞亞群的比例進(jìn)行線性相關(guān)分析,計算相關(guān)系數(shù)r=-0.314 4(P=0.126,見圖3),表明兩種乳腺癌CSCs細(xì)胞亞群的比例沒有相關(guān)性,其兩種標(biāo)志物的表達(dá)相互獨(dú)立。

2.4 ALDH1-與ALDH1-中CD44+CD24-細(xì)胞亞群比例的比較

本研究同時標(biāo)記了兩種標(biāo)志物,分別分析了6種乳腺癌細(xì)胞ALDH1+、ALDH1-與總體細(xì)胞中CD44+CD24-細(xì)胞亞群的比例,結(jié)果發(fā)現(xiàn)與ALDH1+細(xì)胞相比,ALDH1-細(xì)胞中CD44+CD24-細(xì)胞亞群的比例并無差異(見圖4,5);此外,ALDH1+或ALDH1-與未標(biāo)記細(xì)胞相比,CD44+CD24-細(xì)胞亞群的比例均無差異。

圖3 乳腺癌細(xì)胞系中CD44+CD24-細(xì)胞亞群與ALDH1+細(xì)胞亞群的相關(guān)性分析Figure 3 The correlation between CD44+CD24-subpopulation and ALDH1+subpopulation in breast cancer metastatic cell lines

圖4 ALDH1+細(xì)胞亞群中CD44+CD24-的比例Figure 4 The ratio of CD44+CD24-subpopulation in ALDH1+breast cancer cells

圖5 ALDH1-細(xì)胞亞群中CD44+CD24-的比例Figure 5 The ratio of CD44+CD24-subpopulation in ALDH1-breast cancer cells

3 討論

2003年,Al-Hajj等[5]在乳腺癌中發(fā)現(xiàn)CD44+CD24-/low細(xì)胞亞群具有乳腺癌干細(xì)胞特性,CD44/CD24成為首個乳腺癌干細(xì)胞標(biāo)志物。2007年,Ginestier等[8]發(fā)現(xiàn)ALDH1同樣也可作為乳腺癌干細(xì)胞以及多種CSCs的標(biāo)志物。既然這兩種CSCs標(biāo)志物都可以標(biāo)記分離乳腺癌干細(xì)胞,CD44+CD24-細(xì)胞亞群與ALDH1+的細(xì)胞亞群應(yīng)為同一亞群,則同時標(biāo)記CD44/CD24與ALDH1在流式散點(diǎn)圖上應(yīng)當(dāng)會有較高重合細(xì)胞部分。然而,不論從Ginestier等[8]已發(fā)表的論文還是從本文的研究結(jié)果來看,這兩種標(biāo)記物所標(biāo)記的細(xì)胞群均只有部分重疊。我們發(fā)現(xiàn),CD44+CD24-細(xì)胞亞群比例在ALDH1+、ALDH1-以及總體未標(biāo)記細(xì)胞總體中均無顯著差異,說明兩種標(biāo)記物在細(xì)胞中的表達(dá)是相互獨(dú)立、互不影響的。此外,這CD44/CD24與ALDH1所標(biāo)記的細(xì)胞群并不能夠完全等同于CSCs,而是可能包含了CSCs,或者僅代表了不同的CSCs的亞群。

如何解釋這一現(xiàn)象?我們認(rèn)為這是CSCs本身存在的異質(zhì)性導(dǎo)致的。早期人們認(rèn)為CSCs有著較為均一的細(xì)胞表型和生物學(xué)性狀,并且可以用特定標(biāo)志物進(jìn)行標(biāo)記,因此之后的研究中許多研究者都致力于尋找更好的標(biāo)記物。然而,近年來人們發(fā)現(xiàn),CSCs可能是由具有不同功能表型、不同功能狀態(tài)的多個亞群組成的,即CSCs本身具有細(xì)胞增殖狀態(tài)、藥物治療敏感性方面的異質(zhì)性[11-13]。例如,研究者利用單細(xì)胞測序技術(shù)對結(jié)腸癌細(xì)胞進(jìn)行了細(xì)胞譜系追蹤[14],結(jié)果發(fā)現(xiàn)了CSCs的3個亞群,即靜止的具有自我更新能力的細(xì)胞、延遲或緩慢增殖的細(xì)胞和活躍增殖的細(xì)胞,在腫瘤進(jìn)展中扮演著不同的角色,分別引起腫瘤轉(zhuǎn)移或生長。以上研究提示我們,CSCs的確存在不同表型的細(xì)胞亞群。新近,科學(xué)家提出了CSCs異質(zhì)性的3個模型,即等級模型、共進(jìn)化模型和可塑性模型[13]。等級模型是指腫瘤中存在長壽命CSCs與短時CSCs;長壽命CSCs可產(chǎn)生短時CSCs及定向祖細(xì)胞,進(jìn)而CSCs干性逐漸下降,直至產(chǎn)生過渡增殖和終末分化細(xì)胞。共進(jìn)化模型強(qiáng)調(diào),預(yù)先存在的CSCs由于遺傳或表觀遺傳改變,同時或相繼產(chǎn)生多個CSCs。可塑性模型指出,由于自發(fā)和隨機(jī)轉(zhuǎn)變,CSCs可以在不同的細(xì)胞狀態(tài)之間隨機(jī)切換,包括干細(xì)胞狀態(tài)和非干細(xì)胞狀態(tài)的轉(zhuǎn)換;如,CSCs可從非干細(xì)胞中重新出現(xiàn),其狀態(tài)在腫瘤微環(huán)境中受到動態(tài)調(diào)節(jié),因而CSCs可能由不同功能與表型的、動態(tài)變化的多個CSCs亞群組成。這三個模型分別從多個CSCs亞群產(chǎn)生的不同機(jī)制,闡明了CSCs的異質(zhì)性。

那么,現(xiàn)有CSCs標(biāo)志物與CSCs亞群又有著什么聯(lián)系呢?我們認(rèn)為,一些CSCs標(biāo)志物可能僅僅代表了CSCs具有某種特性的亞群,如有報道在鱗狀細(xì)胞癌中存在兩種不同的CSCs亞群[15],可以通過上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)換(epithelial-mesenchymal transition,EMT)或間質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)換(mesenchymal-epithelial transition,MET)相互轉(zhuǎn)換。兩種亞群在腫瘤發(fā)展過程有著不同的功能,其中CD44highESAhigh細(xì)胞亞群有很強(qiáng)的增殖能力,而CD44highESAlowALDH1+的細(xì)胞亞群雖然增殖能力弱,卻有著很強(qiáng)的轉(zhuǎn)移能力,并能起始新的轉(zhuǎn)移性腫瘤。新近在乳腺癌的基因表達(dá)譜分析研究表明,EpCAM+CD24-CD44+細(xì)胞亞群是靜息態(tài)CSCs,表達(dá)EMT相關(guān)基因;而ALDH1+細(xì)胞亞群具有上皮表型,與自我更新狀態(tài)相關(guān)[16]。此外,CSCs的EMT和MET狀態(tài)不是固定的,而是在腫瘤微環(huán)境中調(diào)節(jié)作用下保持可塑性,在EMT和MET狀態(tài)之間轉(zhuǎn)換過渡[16-18]。

可見,不同CSCs亞群在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的不同時期、不同狀態(tài)可能起著不同的功能,因此表達(dá)不同的標(biāo)志物。但是,在特定的時期、特定的狀態(tài)下,CSCs特性和表型是相對穩(wěn)定的,這就為我們研究分離和靶向CSCs帶來新的時機(jī)。此外,為了更好地根除CSCs,進(jìn)而明確CSCs不同亞群的功能與聯(lián)系,就必須進(jìn)行不同標(biāo)志物的聯(lián)合使用或交叉使用。