張軍華,劉卓鋒,馬力天

(1渭南市第二醫(yī)院消化內(nèi)科,渭南 714000;2陜西省渭南市大荔縣朝邑農(nóng)場社區(qū)衛(wèi)生服務中心;3陜西省友誼醫(yī)院中醫(yī)科;4空軍軍醫(yī)大學第二附屬醫(yī)院中醫(yī)科;*通訊作者,E-mail:18609254326@163.com)

肝纖維化是臨床常見的慢性疾病,多種因素可以導致該病,包括酗酒[1]、四氯化碳[2]、肝炎病毒[3,4]等。肝纖維化是一個慢性的病理生理過程,肝臟的損傷與修復的過程中就有著肝纖維化的過程[5,6]。肝星形細胞(hepatic stellate cell,HSC)是肝內(nèi)細胞外基質(zhì)(ECM)的主要來源,多種損傷因素均可作用于HSC,使其激活,轉(zhuǎn)化并分泌大量ECM參與肝纖維化的形成和肝臟結(jié)構重建。目前抗肝纖維化的治療方式主要包括:針對病毒性肝炎的抗病毒治療,抗炎保肝藥,HSCs的靶向抑制劑以及促ECM降解的藥物。隨著中醫(yī)藥的發(fā)展,中草藥抗肝纖維化也逐漸成為優(yōu)選方案。本課題通過體外培養(yǎng)人肝星狀細胞LX-2,使用CCK-8法分別觀察丹參川芎嗪注射液(salvia miltiorrhizae and Ligustrazine,SML)和生脈注射液(Shengmai injection,SMI)單獨用藥與聯(lián)合用藥對LX-2細胞增殖的影響,并選用流式細胞儀觀察聯(lián)合用藥時細胞的凋亡情況。

1 材料與方法

1.1 細胞株和主要試劑

LX-2細胞由空軍軍醫(yī)大學細胞工程學研究中心邊惠潔教授贈與,生脈注射液(No.13070121),丹參川芎嗪注射液(Baite Pharmaceutical),CCK-8檢測試劑盒(碧云天),DMEM(Hyclone),胎牛血清(Every Green),胰酶,流式細胞儀(BD FACSAria,Bection Dickinson,US)。

1.2 LX-2細胞的培養(yǎng)及傳代

常規(guī)培養(yǎng)LX-2細胞(培養(yǎng)基中含10%胎牛血清及100 U/ml青霉素,100 μg/ml鏈霉素),使用倒置顯微鏡觀察細胞數(shù)目,當細胞密度為80% -90%時,胰酶消化并換液。

1.3 藥物濃度的選擇

臨床肝病患者通常體質(zhì)量較輕,在選擇藥物濃度時,假定其體質(zhì)量為50 kg,身高170 cm。人的細胞外液占體質(zhì)量的20%,即細胞外液的總量為10 L。按丹參川芎嗪注射液每次靜注10 ml(臨床常用劑量)計算,體內(nèi)平均藥物濃度為1 μl/ml。因此選擇丹參川芎嗪注射液的濃度梯度為1,2,4,8,16 μl/ml。生脈注射液臨床常用劑量為20-60 ml/次,換算成人體內(nèi)藥物濃度為2-6 μl/ml。因此生脈注射液濃度為0.6,1.2,2.4,4.8,6 μl/ml。

1.4 CCK-8法檢測細胞增殖

1.5 CCK-8法檢測丹參川芎嗪注射液聯(lián)合生脈注射液對LX-2細胞增殖的影響

方法同上,根據(jù)上述實驗結(jié)果以及臨床藥物的用量,我們選擇丹參川芎嗪注射液1 μl/ml,生脈注射液4.8 μl/ml進行聯(lián)合用藥。實驗共分四組:丹參川芎嗪注射液(1 μl/ml)組,生脈注射液(4.8 μl/ml)組,聯(lián)合用藥組(濃度同前兩組),空白對照組(不加任何藥物干預)。取均值計算增殖抑制率,計算公式同上。

1.6 聯(lián)合用藥24 h細胞的凋亡情況

實驗分組同上,將LX-2細胞常規(guī)接種于6孔培養(yǎng)板,待其長到80%,更換培養(yǎng)基,并按照實驗分組給予相應藥物作用24 h,用4 ℃ PBS緩沖液洗細胞2次,收集細胞并用1×的Binding Buffer緩沖液制成1×106細胞/ml的懸液,之后按照流式細胞儀說明書上機檢測。

1.7 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 丹參川芎嗪注射液和生脈注射液對LX-2細胞增殖的影響

丹參川芎嗪注射液作用24 h,與對照組相比,除1,2 μl/ml外,其余濃度均對LX-2細胞有抑制作用(P<0.05,見圖1),抑制率分別為13.21% ,25.74% ,31.86% 。藥物作用48 h,除1 μl/ml,其余濃度梯度均對LX-2細胞有抑制作用(P<0.05),抑制率分別為16.40% ,28.50% ,31.82% ,37.20% 。生脈注射液作用24 h,與對照組相比,除0.6,1.2 μl/ml外,其余濃度均對LX-2細胞有抑制作用(P<0.05,見圖1),抑制率分別為14.87% ,20.30% ,31.16% 。藥物作用48 h,除0.6,1.2 μl/ml外,其余濃度均對LX-2細胞有抑制作用(P<0.05),抑制率分別為14.08% ,34.13% ,77.82% 。

與空白對照組相比,*P<0.05圖1 丹參川芎嗪和生脈注射液對LX-2細胞增殖的影響Figure 1 Effect of salviae miltiorrhizae and ligustrazine on the proliferation of LX-2 cell

2.2 聯(lián)合用藥對LX-2細胞增殖的影響

CCK-8法顯示,藥物作用24 h,與空白對照組相比,聯(lián)合用藥組和生脈注射液(SMI)組均對LX-2細胞增殖有抑制作用(P<0.05),且聯(lián)合用藥組的抑制率高于兩單獨用藥組(P<0.05)。藥物作用48 h,與空白對照組相比,聯(lián)合用藥組,生脈注射液(SMI)組和丹參川芎嗪(SML)組均對LX-2細胞增殖有抑制作用(P<0.05),且聯(lián)合用藥的效果要好于丹參川芎嗪單獨用藥(P<0.05，見圖2)。當藥物作用48 h,雖然聯(lián)合用藥組的抑制率(39.41% )要高于生脈組(32.65% ),但是差異沒有統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.3 聯(lián)合用藥對LX-2細胞凋亡的影響

細胞凋亡的早期,磷脂酰絲氨酸(PS)會從細胞膜內(nèi)轉(zhuǎn)移到細胞膜外。Annexin Ⅴ具有易于PS結(jié)合的特性,因此可以將標記了熒光素(FITC)的Annexin Ⅴ作為探針,來檢測細胞凋亡的發(fā)生。碘化丙啶(PI)不能透過完整的細胞膜,但可以透過凋亡中晚期和壞死的細胞并使細胞核紅染。將Annexin Ⅴ與PI結(jié)合使用,就可以區(qū)分早期凋亡,中晚期凋亡和壞死的細胞[7]。

聯(lián)合用藥組的凋亡細胞占21.3% ,丹參川芎嗪(SML)組的凋亡細胞占9.5% ,生脈注射液(SMI)組的凋亡細胞占11.7% 。聯(lián)合用藥組的促凋亡作用要高于單獨用藥(見圖3)。

與空白對照組相比,*P<0.05；與丹參川芎嗪組比較，#P<0.05;與生脈注射液比較，△P<0.05圖2 聯(lián)合用藥對LX-2細胞增殖的影響Figure 2 Effect of SML combined with SMI on the proliferation of LX-2 cell

B4代表早期凋亡細胞；B2代表中晚期凋亡細胞；B4+B2代表凋亡細胞圖3 聯(lián)合用藥作用24 h后LX-2細胞的凋亡情況Figure 3 Apoptosis of LX-2 cells treated by SML and SMI at 24 h

3 討論

肝纖維化的發(fā)生是一種復雜的動態(tài)的變化過程。在其發(fā)生發(fā)展的過程中,肝星形細胞(HSC)的地位非常關鍵[8]。當HSC受到某種致病因素的刺激時,可以被激活并不斷增殖,表型變?yōu)槌杉±w維細胞(myofibroblast,MFB)[9,10]。許多的細胞外基質(zhì)(ECM)被合成[11,12],最終導致肝纖維化的發(fā)生[13]。多個信號通路,生長因子以及細胞因子均可調(diào)控ECM的合成和降解,包括TGF-beta/Smad信號通路[14]、PDGF[15]、以及FAK信號通路[16]等。

傳統(tǒng)醫(yī)學認為,“血為氣之母”,“淤血不去則新血不生”。臨床上,此類病人常因體內(nèi)長期存在淤血,使新血不生,必然導致化氣乏源,故此類病人除陰虛之外,常伴有少氣懶言,乏力等氣虛癥狀。部分中藥在治療肝纖維化的過程中有著較好的療效[17],綜合運用現(xiàn)代醫(yī)學技術和中醫(yī)辨證治療,可以提高治療效果和存活率[18]。丹參川芎嗪的主要成分是丹參素和鹽酸川芎嗪,川芎嗪可能增加肝內(nèi)SOD水平,促進肝臟細胞再生[19],并促進自噬溶酶體降解,從而干擾其肝纖維化的過程[20]。

生脈注射液是在古方“生脈散”(人參,麥冬,五味子)的基礎上利用現(xiàn)有的技術提取制備而成的中藥注射液。其中,人參可以通過調(diào)節(jié)前列腺素E2和基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(TIMP-1)來抑制肝纖維化的過程[21],并且人參及其所含的部分化學物質(zhì)對各種肝炎病毒引起的肝損傷有保護作用[22]。麥冬中所含的麥冬多糖可以清除氧自由基,并且具有抗氧化功能,可以減輕由CCl4引起的肝損傷[23]。五味子對大鼠肝星狀細胞HSC-T6有抑制作用,并可能抑制肝纖維化[24]。在衛(wèi)生部頒藥品標準(中藥成方制劑第十五冊)中[25],生脈注射液由紅參,麥冬,五味子三味中藥組成,并規(guī)定,每1 ml中含人參皂甙Rg1不得少于0.08 g,含人參皂甙Re不得少于0.04 g?，F(xiàn)代藥理學研究表明,Rg1可以降低糖尿病大鼠血糖,血脂并對其血管損傷有保護作用[26],還可以治療大鼠坐骨神經(jīng)損傷[27]等。Re具有改善阿爾茲海默病小鼠的學習記憶能力[28]和保護保護糖尿病大鼠心肌的作用[29]等。

在本實驗中,首先通過CCK-8法檢測了不同劑量的丹參川芎嗪注射液和生脈注射液對LX-2細胞的影響,結(jié)果顯示,藥物作用24 h和48 h,小劑量丹參川芎嗪(1 μl/ml)和小劑量生脈注射液(0.6,1.2 μl/ml)對LX-2細胞抑制作用不顯著,但增加藥物濃度之后,對LX-2細胞的抑制作用顯著。聯(lián)合用藥24 h,聯(lián)合用藥對LX-2細胞的抑制率要顯著高于單獨用藥(P<0.05);聯(lián)合用藥48 h,聯(lián)合用藥組的抑制率要顯著高于丹參川芎嗪單獨用藥(P<0.05)。聯(lián)合用藥和生脈注射液相比,聯(lián)合用藥組的抑制率(39.41%)要高于生脈組(32.65% ),但統(tǒng)計學分析表明兩組間的差異并不顯著(P>0.05)。我們認為,有很多原因會造成這樣的結(jié)果,一個重要的原因是接種于96孔板時,所種細胞不均勻,當部分區(qū)域的細胞數(shù)量特別多時,會導致對藥物的敏感性下降。在我們前期的研究中也發(fā)現(xiàn):不同濃度的生脈注射液對不同密度的細胞的影響也不同,當細胞密度較大時,其對同一濃度的藥物的敏感性就會降低,當藥物濃度過低時,其對細胞的抑制作用也會大打折扣[30]。

綜上所述,本研究采用CCK-8法和流式細胞術證明,一定濃度的丹參川芎嗪和生脈注射液可以抑制肝星形細胞LX-2的增殖,并且聯(lián)合用藥24 h,其對LX-2的抑制率要高于單獨用藥。為臨床用藥提供了可能的指導,并為進一步研究抗肝纖維化藥物提供了參考。