李 龍，劉鎖珠

(1.楊凌職業(yè)技術(shù)學(xué)院 動(dòng)物工程分院，陜西楊凌 712100；2.西藏農(nóng)牧學(xué)院 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，林芝 860000)

在肉雞育種中，由于育種人員過(guò)分重視提高體質(zhì)量增長(zhǎng)速度和飼料轉(zhuǎn)化率，忽略心肺生長(zhǎng)的選育，造成現(xiàn)有肉仔雞品種心肺功能存在缺陷，肺動(dòng)脈高壓和右心衰竭的發(fā)生率遠(yuǎn)高于其他雞種[1-2]。缺氧環(huán)境會(huì)增加肉雞腹水癥的發(fā)生率，而營(yíng)養(yǎng)手段是目前能夠有效預(yù)防肉雞腹水癥發(fā)生的主要措施。前期研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加紅景天水提物干粉(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0.2%和 0.4%)能夠顯著降低缺氧條件下肉雞右心指數(shù)和腹水死亡率(已接受，待刊)，部分原因可能是紅景天能夠抑制轉(zhuǎn)錄因子 HIF-1α 的降解。HIF-1α 是機(jī)體應(yīng)對(duì)缺氧的一種重要轉(zhuǎn)錄因子，其可以誘導(dǎo)EPO基因的表達(dá)增加從而提高動(dòng)物體紅細(xì)胞數(shù)目[3]，同時(shí) HIF-1α 還能夠影響內(nèi)皮素基因的表達(dá)，從而改變動(dòng)物機(jī)體在缺氧環(huán)境下的心血管機(jī)能[4]。內(nèi)皮素在心血管疾病引起的心臟衰竭中起重要作用，其中內(nèi)皮素-1(ET-1)既是機(jī)體維持正常生理狀態(tài)的生理調(diào)節(jié)因子，又是在某些病理狀態(tài)下產(chǎn)生和釋放的一種重要的致病因子[5]。 ET-1 是一個(gè)由 21 個(gè)氨基酸組成的具有血管收縮活性的多肽， ET-1受體有 ETA和 ETB2 種亞型，ETA在心肌中占主導(dǎo)地位[6]，血管中 ETA亞型主要在血管平滑肌細(xì)胞表達(dá)，而ETB受體在內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)。刺激 ETA受體會(huì)引起收縮增殖和遷移，而刺激 ETB受體會(huì)引起具有擴(kuò)增血管、降低血壓作用的一氧化氮(NO)釋放[7]。心臟中 ETA和 ETB是共存的，ET-1 發(fā)揮作用主要依靠 ETA和 ETB的調(diào)節(jié)[8]。Hassanpour等[9]研究發(fā)現(xiàn)在三碘甲狀腺原氨酸(T3)誘導(dǎo)的肉雞腹水癥模型中， ET-1 及其受體 ETAR 參與肉雞血壓的維持，在肉雞腹水癥的發(fā)病過(guò)程中起重要作用。但目前關(guān)于紅景天提取物是否能夠通過(guò)影響肉仔雞ET-1及其受體基因表達(dá)緩解缺氧條件下肉雞腹水癥發(fā)生的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。因此，本試驗(yàn)旨在研究不同紅景天提取物添加量對(duì)高原缺氧條件下肉雞血清內(nèi)皮素水平、左右心室ET-1、ETAR和ETBRmRNA 表達(dá)水平的影響，為利用紅景天在高原缺氧條件下肉雞腹水癥的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將 450 只 1 日齡 AA 雛雞(雄性)隨機(jī)分為 5個(gè)組，每組6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù) 15 只雞。試驗(yàn)所需肉雞均購(gòu)自四川成都，出殼當(dāng)日空運(yùn)至西藏林芝西藏農(nóng)牧學(xué)院教學(xué)實(shí)習(xí)基地(海拔 2 986 m)，進(jìn)行為期 42 d 的飼養(yǎng)試驗(yàn)。試驗(yàn)過(guò)程中肉仔雞采用籠養(yǎng)，自由采食、飲水。試驗(yàn)基礎(chǔ)日糧為肉雞商品全價(jià)配合飼料，其中，0～21 d 飼喂前期料(代謝能 12.7 MJ/kg；粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 21.8%)，22～42 d飼喂后期料(代謝能13.2 MJ/kg；粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%)。5 個(gè)組分別在基礎(chǔ)日糧中添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0(對(duì)照組)、0.1%、0.15%、0.2%和 0.4%的紅景天水提物干粉。

1.2 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.2.1 心臟指數(shù)測(cè)定 在第14、28 和 42天，每個(gè)重復(fù)隨機(jī)選取 1 只雞稱(chēng)質(zhì)量并頸部放血處死。解剖后取出心臟，剝離附著的脂肪與血塊，沿冠狀溝切除心房，稱(chēng)總心室質(zhì)量(Total ventricles mass, TV)，再沿縱溝分別剪下右心室(Right ventricles mass, RV)稱(chēng)量，分別計(jì)算(右心指數(shù)RV/TV)和 RV/100g體質(zhì)量 BW。肉雞右心指數(shù)大于 0.29 則判定肉雞發(fā)生肺動(dòng)脈高壓綜合癥[10]。左右心室稱(chēng)量后迅速放入液氮中凍存，備用。

1.2.2 RNA提取與熒光定量PCR 利用 RNA 提取試劑盒(全式金)提取左心和右心總 RNA，操作過(guò)程嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(全式金)將1 μg總 RNA 反轉(zhuǎn)錄為 cDNA，-20 ℃保存，備用。以GADPH 基因?yàn)閮?nèi)參基因進(jìn)行定量分析，通過(guò)2-ΔΔCt方法計(jì)算ET-1、ETAR和ETBR的mRNA 表達(dá)量，利用 Primer Premier 5.0 軟件進(jìn)行熒光定量引物設(shè)計(jì)，引物具體信息見(jiàn)表1。

表1 qRT-PCR檢測(cè)基因與引物Table 1 Primers used to analyze gene expression by quantitative PCR

1.2.3 血清內(nèi)皮素水平檢測(cè) 在第14、28和42天，每個(gè)重復(fù)隨機(jī)選取 1 只雞翼靜脈采血，離心取上清，-20 ℃保存，備用。利用內(nèi)皮素 ELISA 檢測(cè)試劑盒(Cayman)檢測(cè)血清中 ET-1 水平，操作嚴(yán)格按照試劑盒規(guī)定方法進(jìn)行，每個(gè)樣品測(cè)定 3 次，取平均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

采用 SPSS 19.0 軟件的 one-way ANOVA對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，用Duncan’s 法進(jìn)行多重比較，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅景天提取物對(duì)肉雞心臟指數(shù)和血清內(nèi)皮素水平的影響

由表 2 可知，在 第14天， 各處理組之間的心臟指數(shù)和血清內(nèi)皮素水平均無(wú)顯著差異(P>0.05)。相比于對(duì)照組，0.2%和0.4%紅景天組28 和 42 d血清 ET-1 水平及42 d的 RV/TV(右心指數(shù))和 RV/BW(P<0.05)顯著降低 。在第28天和42天，0.2%和0.4%紅景天組肉雞血清內(nèi)皮素水平顯著高于 0.1%和0.15% 紅景天組(P<0.05)，第42天RV/TV 和 RV/BW 顯著低于 0.1%和 0.15%紅景天組(P<0.05)。在整個(gè)飼養(yǎng)期，0.1%和 0.15%紅景天組與對(duì)照組在心臟指數(shù)和血清內(nèi)皮素水平上均無(wú)顯著差異(P>0.05)。

2.2 紅景天提取物對(duì)高原缺氧條件下肉雞左右心室 ET-1及其受體基因表達(dá)的影響

由表 3 可知，在第28天和第42天相比于對(duì)照組， 0.2%和 0.4%紅景天組肉雞左右心室中ET-1mRNA 表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，右心室ETARmRNA 表達(dá)量顯著升高(P<0.05)。同時(shí) 0.2%和 0.4%紅景天組左右心室ET-1mRNA 表達(dá)量顯著低于0.1%和 0.15%紅景天組(P<0.05)，而右心室ETARmRNA 表達(dá)量顯著高于 0.1%和0.15%紅景天組(P<0.05)。0.1%和 0.15%紅景天組與對(duì)照組在第14、28 和42天ET-1、ETAR和ETBR3 個(gè)基因的表達(dá)量均無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表2 肉雞心臟指數(shù)和血清內(nèi)皮素水平Table 2 The cardiac indices and serum ET-1 level of broiler

注：同行數(shù)據(jù)不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。

Note:In the same row, values with different lowercase letters mean significant difference (P<0.05).The same below.

表3 肉雞左右心室 ET-1及其受體mRNA表達(dá)Table 3 The mRNA level of endothelin-1 and its receptors in the left and right ventricles of broiler

3 討 論

右心肥大是肺動(dòng)脈高壓的直觀生理表現(xiàn)，因此右心指數(shù)(RV/TV)被認(rèn)為是判斷肉雞肺動(dòng)脈高壓的最重要指標(biāo)[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，在西藏真實(shí)缺氧的環(huán)境中，第14 和 28天時(shí)對(duì)照組肉雞并未發(fā)生肉雞肺動(dòng)脈高壓綜合癥(RV/TV小于 0.29)，但在第42天時(shí)肉雞出現(xiàn)明顯的肺動(dòng)脈高壓綜合癥(RV/TV大于 0.29)，這主要是因?yàn)槿怆u在 28 d 后體質(zhì)量過(guò)大，而肉雞本身單位體質(zhì)量代謝率(耗氧量)大約是其他哺乳動(dòng)物的 2～2.5 倍[12]，造成肉雞后期需氧量過(guò)大，導(dǎo)致肺動(dòng)脈高壓，形成右心肥大。

ET-1 是心血管系統(tǒng)產(chǎn)生的一種高效的血管收縮劑，已有大量研究表明 ET-1 系統(tǒng)紊亂是形成肺動(dòng)脈高壓的重要機(jī)制。在人體上研究發(fā)現(xiàn)先天性肺動(dòng)脈高壓患者血液中 ET-1 的水平顯著高于正常人群[13]，同樣在肉雞試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)給肉雞飼喂 BQ123(ETAR 阻斷劑)顯著降低肉雞肺動(dòng)脈高壓的發(fā)生率，提示 ET-1 在肉雞的肺動(dòng)脈高壓發(fā)生中同樣發(fā)揮重要作用[14]。這些結(jié)果都說(shuō)明 ET-1 水平與心肌損傷和心臟衰竭高度相關(guān)，而本研究發(fā)現(xiàn)在第42天 時(shí)， 0.2%和0.4%紅景天組血清中 ET-1 水平降低的同時(shí)右心指數(shù)顯著降低，肉雞肺動(dòng)脈高壓緩解，進(jìn)一步證實(shí)肉雞血液 ET-1 水平的升高是引起肺動(dòng)脈高壓綜合癥的一個(gè)重要誘因。紅景天作為緩解缺氧的一種傳統(tǒng)藏藥，緩解高原缺氧損傷的一個(gè)重要機(jī)制是降低血液中 ET-1 的水平，這在體外[15]和體內(nèi)[9]試驗(yàn)中都得到證實(shí)，而本研究同樣發(fā)現(xiàn)在肉雞飼料中添加紅景天提取物能夠顯著降低血液 ET-1 水平。

本研究發(fā)現(xiàn)，肉雞左右心室都能表達(dá)ET-1基因，并且隨著飼養(yǎng)期的增加表達(dá)量不斷上升，這與前人的研究結(jié)果一致[16]。Hassanpour等[9]研究發(fā)現(xiàn)三碘甲狀腺原氨酸(T3)誘導(dǎo)的肉雞肺動(dòng)脈高壓綜合癥模型下肉雞左右心室ET-1的表達(dá)量都會(huì)下降，而在哺乳動(dòng)物模型(兔子、人)中的研究發(fā)現(xiàn)卻和肉雞肺動(dòng)脈高壓情況下左右心室ET-1表達(dá)水平變化不同[16-17]，這可能是由于 ET-1 在鳥(niǎo)類(lèi)和哺乳動(dòng)物中的調(diào)節(jié)機(jī)制不同造成的。而本研究發(fā)現(xiàn)紅景天提取物能夠顯著降低第28天和第42天肉雞左右心室中ET-1mRNA的表達(dá)量，但這個(gè)結(jié)果還不足以說(shuō)明血液中 ET-1 的水平降低與紅景天提取物降低左右心室ET-1mRNA 表達(dá)量有關(guān)，這主要是由于ET-1除左右心室以外的其他很多種類(lèi)型的細(xì)胞都能夠分泌[15]。ETAR和ETBR對(duì)ET-1的功能具有重要的調(diào)節(jié)作用，本研究發(fā)現(xiàn) 0.2%和0.4%紅景天組顯著提高右心室ETARmRNA的表達(dá)量，但所有紅景天組對(duì)左心室ETAR和ETBRmRNA的表達(dá)量都無(wú)顯著影響，提示紅景天可能通過(guò)影響右心室 ETAR 的表達(dá)量來(lái)改善肉雞肺動(dòng)脈高壓綜合癥。

本研究發(fā)現(xiàn)飼喂 0.2%和0.4%紅景天水提物干粉能夠顯著影響缺氧條件下肉雞血液ET-1水平、右心指數(shù)、ET-1及其受體 mRNA 表達(dá)量，但 0.1%和 0.15%紅景天組對(duì)測(cè)定指標(biāo)均無(wú)顯著影響，提示紅景天提取物發(fā)揮作用存在計(jì)量依懶性，高于 0.2%才能夠發(fā)揮作用，這可能與紅景天水提物中活性成分有關(guān)。

4 結(jié) 論

本研究發(fā)現(xiàn)，飼喂0.2%和 0.4%紅景天水提物干粉能夠改善高原缺氧條件下肉雞肺動(dòng)脈高壓綜合癥，這一作用與紅景天降低血液ET-1水平，降低左、右心室ET-1mRNA 表達(dá)水平和提高右心室ETARmRNA 表達(dá)水平有關(guān)。