李 姣 張曉峰 王霄凱 王婉愉

(鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，河南 鄭州 450001)

高良姜是姜科山姜屬植物高良姜 (AlpiniaofficinarumHance) 的干燥根莖，也稱為高涼姜、佛手根、小良姜、良姜，主要生長于廣東、廣西、福建、云南等地[1]，為藥食同源植物。國內(nèi)外研究[2-3]表明，高良姜具有抗菌鎮(zhèn)痛、抗炎、抗腫瘤、抗增殖、抗氧化、抗腹瀉等多種生理功能，也可作為抗氧化劑應(yīng)用于食品的貯藏[4]，已被應(yīng)用于食品調(diào)味料、香料和保健品等方面[5-6]。

氧化應(yīng)激是指機(jī)體新陳代謝過程中活性氧和活性氮的產(chǎn)生與清除失衡，導(dǎo)致活性氧和活性氮產(chǎn)生過多，造成機(jī)體組織細(xì)胞和生物大分子損傷，是許多疾病發(fā)生的重要因素[7]，因此提高機(jī)體抗氧化能力有助于維持機(jī)體的健康水平。多酚和黃酮類化合物是高良姜中的主要生物活性成分之一[8]。研究[9-10]表明植物多酚能降低機(jī)體活性氧水平，并可通過抗炎、抗誘變和抗血栓等功能促進(jìn)機(jī)體健康。黃酮是多酚類化合物家族中非常重要的成員，同樣具有抗氧化及抗腫瘤等方面的功能。胰脂肪酶與α-葡萄糖苷酶均為消化吸收過程中的關(guān)鍵酶，在機(jī)體的許多代謝過程中發(fā)揮著重要作用，與肥胖、糖尿病、動脈硬化等由機(jī)體代謝失調(diào)引發(fā)的疾病有密切關(guān)系[11]。若對二者酶活性進(jìn)行抑制可減少機(jī)體對膳食碳水化合物和脂類的消化吸收，從而達(dá)到防治代謝相關(guān)疾病的目的。

目前高良姜的相關(guān)研究主要集中在組分提取、分離鑒定以及抑菌[12]、抗炎[13]和抗腫瘤方面[14]，而對胰脂肪酶和α-葡萄糖苷酶活性抑制作用的研究較少。王輝等[15]僅對高良姜不同部位乙醇提取物的α-葡萄糖苷酶活性抑制作用進(jìn)行研究。本研究擬以高良姜為原料，通過對其甲醇提物中多酚和總黃酮含量、抗氧化活性以及對胰脂肪酶與α-葡萄糖苷酶的抑制活性的測定，探討高良姜體外抗氧化活性及其在調(diào)節(jié)糖脂代謝方面的能力，以期為高良姜的進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

新鮮高良姜：市售，經(jīng)鄭州大學(xué)藥學(xué)院中藥教研室教授鑒定為姜科植物高良姜。

1.2 試劑及儀器

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼 (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl, DPPH)、2,2’-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽[2,2’-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonate)，ABTS]、2,4,6-三(2-吡啶基)三嗪 [2,4,6-tris(2-pyridyl)-s-triazine，TPTZ]、α-葡萄糖苷酶 [酶活力≥10 U/mg]、胰脂肪酶(酶活力30～90 U/mg)：分析純，美國Sigma公司；

槲皮素、沒食子酸 (gallic acid, GA)、4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷 (4-Nitrophenyl-α-D-glucopyranoside，PNPG)、Tris-HCl：分析純，上海阿拉丁試劑公司；

其他試劑：分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；

真空冷凍干燥機(jī)：LGJ-18B型，北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司；

電熱鼓風(fēng)干燥箱：10-2BS型，天津市華北實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：RE-2000型，上海亞榮生化儀器廠；

臺式離心機(jī)：5424R型，艾本德中國有限公司；

多功能微孔板讀數(shù)儀：Spectra Max M2e型，美谷分子儀器有限公司；

電子分析天平：AL204 型，梅特勒—托利多儀器(上海)有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品甲醇提取物的制備 將新鮮高良姜放于冷凍干燥機(jī)中凍干，粉碎過篩(60目)，使用CCl4在通風(fēng)櫥中脫脂[1∶10 (g/mL) ] 24 h，抽濾晾干。稱取15 g脫脂干粉，加150 mL甲醇，浸提24 h后抽濾；重復(fù)浸泡2次，濾液合并濃縮冷凍干燥。稱取凍干粉0.5 g，加1 mL甲醇配成500 mg/mL樣品提取液，4 ℃儲存。

1.3.2 多酚和總黃酮含量的測定 多酚含量的測定參照Ainsworth等[16]的方法，結(jié)果以每克干粉所含的沒食子酸當(dāng)量 (mg GAE /g DW) 表示?？傸S酮含量的測定根據(jù)Arvouet-Grand等[17]的方法，并修改如下：取100 μL待測提取液并梯度稀釋，加入等量的2% AlCl3甲醇溶液，25 ℃靜置10 min，于415 nm波長處測量吸光度，最終以每克干粉所含的槲皮素當(dāng)量 (mg QE /g DW) 表示。

1.3.3 抗氧化活性的測定

(1) DPPH自由基清除能力的測定：參照Cheng等[18]的方法，DPPH自由基離子的清除率按式(1)計算。

(1)

式中：

c—— DPPH自由基離子清除率，%；

m1—— 100 μL DPPH溶液+100 μL樣品液的吸光度值；

m2—— 100 μL甲醇溶液+100 μL樣品液的吸光度值；

m0—— 100 μL DPPH溶液+100 μL甲醇溶液的吸光度值。

(2) ABTS自由基清除能力的測定：參照Ali等[19]的方法，并對ABTS自由基離子清除率計算公式稍作修正，見式(2)。

(2)

式中：

c—— ABTS自由基離子清除率，%；

m1—— 180 μL ABTS+·工作液+20 μL樣品液的吸光度值；

m2—— 180 μL乙醇溶液+20 μL樣品液的吸光度值；

m0—— 20 μL乙醇溶液+180 μL ABTS+·工作液的吸光度值。

(3)鐵離子還原能力的測定：參照Sreerama等[20]的方法，結(jié)果用每克樣品干重中相當(dāng)于Fe2+的微摩爾數(shù) (μmol Fe2+/g DW)值表示。

1.3.4 代謝關(guān)鍵酶抑制活性的測定

(1) 胰脂肪酶抑制活性的測定：參照Mcdougall等[21]的方法，并修改如下：于1.5 mL離心管中加入50 μL樣品提取液并梯度稀釋，再加150 μL酶工作液與350 μL 0.1 mol/L Tris-HCl緩沖液 (pH=8.2)，37 ℃預(yù)熱10 min 后加入450 μL底物工作液，37 ℃下反應(yīng)2 h。反應(yīng)終止后，16 000 r/min離心3 min，移取300 μL上清液至96孔板，測定405 nm波長處的吸光度。胰脂肪酶活性的抑制率按式(3)計算。

(3)

式中：

c—— 胰脂肪酶活性抑制率，%；

m1—— 50 μL樣品液+150 μL酶工作液+350 μL Tris-HCl緩沖液+450 μL底物工作液的吸光度值；

m2—— 以150 μL Tris-HCl緩沖液替代酶工作液的吸光度值；

m3—— 以50 μL甲醇替代樣品液的吸光度值；

m4—— 以50 μL甲醇替代樣品液，150 μL Tris-HCl緩沖液替代酶工作液的吸光度值。

(2)α-葡萄糖苷酶抑制活性的測定：參照Kang等[22]的方法，α-葡萄糖苷酶活性的抑制率按式(4)計算。

(4)

式中：

c——α-葡萄糖苷酶活性抑制率，%；

m1—— 8 μL樣品液+20 μL酶工作液+112 μL PBS緩沖液+20 μL底物工作液的吸光度值；

m2—— 以20 μL PBS緩沖液替代酶工作液的吸光度值；

m3—— 以8 μL甲醇替代樣品液的吸光度值；

m4—— 以8 μL甲醇替代樣品液，以20 μL PBS緩沖液替代酶工作液的吸光度值。

1.4 數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計

采用Microsoft Excel 2016對數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，使用SPSS 21.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。所有試驗(yàn)均重復(fù)3次，結(jié)果以平均值和標(biāo)準(zhǔn)差表示。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 高良姜醇提物中多酚與總黃酮的含量測定結(jié)果

2.1.1 高良姜醇提物中多酚的含量 由圖1 可知，當(dāng)質(zhì)量濃度在0～250 μg/mL時，沒食子酸與吸光度值的線性關(guān)系較好。測得高良姜醇提物中多酚含量為62.91 mg GAE/g DW。

2.1.2 高良姜醇提物中總黃酮的含量 如圖2所示，當(dāng)質(zhì)量濃度在0～200 μg/mL時，槲皮素與吸光度值的線性關(guān)系較好。測得高良姜醇提物中總黃酮含量為13.12 mg QE/g DW。

2.2 高良姜醇提物的抗氧化活性

2.2.1 DPPH自由基清除能力 高良姜醇提物對DPPH自由基清除能力如圖3所示。由圖3可知，高良姜醇提物濃度在6.25～50.00 mg/mL時，其對DPPH自由基的清除能力隨著濃度的增大而增大(Y=23.053lnX+7.307 8，R2=0.98，P<0.01)，且各濃度的清除率之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。當(dāng)高良姜醇提物濃度達(dá)到50 mg/mL 時，其對DPPH自由基的清除率達(dá)到最大值95.78%。醇提物的對DPPH自由基的半抑制濃度IC50值為6.37 mg/mL。若IC50值≤10 mg/mL，可以認(rèn)為該物質(zhì)的抗氧化功能較好[23]，因此高良姜醇提物對DPPH自由基離子的清除能力較強(qiáng)。石雪萍等[24]的研究同樣發(fā)現(xiàn)高良姜總黃酮具有DPPH自由基清除活性，且抗氧化能力呈質(zhì)量濃度依賴性。

圖1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 1 Standard curve of GA

圖2 槲皮素標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 2 Standard curve of quercetin

不同字母表示差異顯著(P<0.05)

2.2.2 ABTS自由基清除能力 高良姜醇提物對ABTS自由基清除能力如圖4所示。由圖4可知，高良姜醇提物濃度在1.56～50.00 mg/mL時，其對ABTS+·的清除能力隨著濃度的增大而增大(Y=18.394lnX+37.751，R2=0.89，P<0.01)，在高良姜醇提物濃度達(dá)到25 mg/mL 時，對ABTS+·的清除能力達(dá)到98.47%，之后隨濃度的增長其清除能力趨于平穩(wěn)。醇提物的對ABTS自由基的半抑制濃度IC50值為2.24 mg/mL，說明醇提物對ABTS自由基的清除能力較強(qiáng)。K?se等[25]分別使用水和乙醇對高良姜進(jìn)行提取，結(jié)果顯示2種提取物均表現(xiàn)出了ABTS自由基離子的清除能力，但乙醇提物的自由基離子清除能力較強(qiáng)。

不同字母表示差異顯著(P<0.05)

2.2.3 鐵離子還原能力 以FeSO4濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制FeSO4標(biāo)準(zhǔn)曲線。如圖5所示，濃度在0～1 000 μmol/L時FeSO4濃度與其在593 nm處的吸光度呈良好的線性關(guān)系。高良姜醇提物的FRAP值為428.92 μmol Fe2+/g DW。

2.3 高良姜醇提物對代謝關(guān)鍵酶的抑制活性

2.3.1 胰脂肪酶抑制活性 高良姜醇提物對胰脂肪酶的抑制活性如圖6所示。從圖6可知，高良姜醇提物對胰脂肪酶具有較好的抑制活性，當(dāng)濃度為62.5 mg/mL時，對胰脂肪酶的抑制率較低 (12.42%)，但隨著濃度的增大，其抑制活性逐漸增強(qiáng)，IC50值為205.87 mg/mL。曲線回歸分析表明在此濃度范圍內(nèi)，對胰脂肪酶抑制活性呈現(xiàn)質(zhì)量濃度依賴性(P<0.05)。

圖5 FeSO4標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 5 Standard curve of FeSO4

圖6 高良姜醇提物對胰脂肪酶抑制活性Figure 6 Pancreatic lipase activity Inhibition of methanol extract of Galangal

2.3.2α-葡萄糖苷酶抑制活性 高良姜醇提物對α-葡萄糖苷酶抑制活性如圖7所示。由圖7可知，高良姜醇提物濃度在62.50～500.00 mg/mL時，對α-葡萄糖苷酶活性的抑制率隨著質(zhì)量濃度的增大而增大，IC50值為1.32 mg/mL，說明在此濃度范圍內(nèi)高良姜醇提物對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用與提取物濃度有明顯的相關(guān)性，并且各濃度下的α-葡萄糖苷酶抑制率之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖7 高良姜醇提物對α-葡萄糖苷酶抑制活性Figure 7 α-glucosidase activity inhibition of methanol extract of Galangal

已有研究表明姜科植物在降糖方面具有較好功效，如生姜[26]、姜黃[27]、草果[28]等在胰脂肪酶和α-葡萄糖苷酶活性抑制方面都有較強(qiáng)的功能，表現(xiàn)出了較好的降血脂、抗糖尿病效果。本研究也發(fā)現(xiàn)姜科植物高良姜表現(xiàn)出較好的胰脂肪酶、α-葡萄糖苷酶抑制活性，且均呈現(xiàn)一定的濃度依賴性。

2.4 高良姜醇提物生物活性與其多酚和總黃酮含量的相關(guān)性分析

為進(jìn)一步探討高良姜醇提物的抗氧化能力和酶抑制功能來源，本試驗(yàn)對高良姜醇提物抗氧化能力、胰脂肪酶和α-葡萄糖苷酶抑制活性與其多酚、總黃酮含量的相關(guān)性分析結(jié)果見表1。

表1高良姜醇提物生物活性與其多酚、總黃酮含量的相關(guān)性分析?

Table 1 Correlation analysis between bioactivities and polyphenols and flavonoids of methanol extract of Galangal

自由基及酶相關(guān)系數(shù) r多酚總黃酮DPPH+·清除能力0.992?0.968?ABTS+·清除能力0.996?0.927?鐵離子還原能力(FRAP)0.941?0.887?α-葡萄糖苷酶0.976?0.858?胰脂肪酶0.990?0.942?

? *表示有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

由表1可知，高良姜醇提物多酚和總黃酮含量均與其3種抗氧化指標(biāo)、胰脂肪酶和α-葡萄糖苷酶抑制活性呈正相關(guān) (P<0.05)，說明高良姜醇提物的體外生物學(xué)活性與其多酚、總黃酮含量有密切聯(lián)系。多酚和黃酮可能是高良姜醇提物中具有抗氧化活性、胰脂肪酶和α-葡萄糖苷酶抑制活性成分的重要組成部分。

3 結(jié)論

作為藥食兩用的植物資源，高良姜醇提物中多酚和總黃酮含量豐富，在測定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，高良姜醇提物清除DPPH和ABTS自由基能力以及鐵離子還原能力較好，對胰脂肪酶和α-葡萄糖苷酶抑制活性隨質(zhì)量濃度的增高而增大。說明高良姜醇提物具有較好的抗氧化活性和代謝關(guān)鍵酶抑制活性，在天然抗氧化劑、降血糖降血脂藥物以及功能性食品的開發(fā)與應(yīng)用方面具有很好的前景。但本試驗(yàn)尚未對醇提物做進(jìn)一步的分離鑒定，其發(fā)揮功能的主要成分有待進(jìn)一步研究。