陶進(jìn)江 潘桂根,2 劉木華 袁海超 趙進(jìn)輝

(1. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)工學(xué)院生物光電及應(yīng)用重點實驗室，江西 南昌 330045；2. 江西工業(yè)貿(mào)易職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江西 南昌 330038)

己烯雌酚(DES)是一種雌性激素，如兒童食用含有DES的食品可導(dǎo)致性早熟，骨骺線提前閉合，身高提前停止生長[1]。然而近些年來關(guān)于鴨肉中激素超標(biāo)的新聞屢屢出現(xiàn)。為了促進(jìn)鴨的快速生長，養(yǎng)殖戶常在飼料中添加DES而造成鴨肉中的DES殘留超標(biāo)。采用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)和液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)等方法檢測DES不僅速度慢而且檢測設(shè)備貴。因此，建立DES在鴨肉中殘留的快速檢測方法十分重要。

表面增強拉曼光譜(SERS)技術(shù)是在普通拉曼光譜法的基礎(chǔ)上，結(jié)合表面增強技術(shù)而研發(fā)出來的一種新技術(shù), 由于具有穩(wěn)定性強、受水與熒光干擾小、方便快捷等特點，已成為了一種高效實用的快速檢測分析工具，并在許多領(lǐng)域獲得了廣泛的應(yīng)用[2-3]。馬海寬等[4]利用SERS和靜電富集相結(jié)合的技術(shù)，實現(xiàn)了快速痕量探測水環(huán)境中環(huán)丙沙星、恩諾沙星、丁胺卡那霉素和磺胺甲基嘧啶。馬君等[5]以銀溶膠膜為基底對3種抗生素(氯霉素、環(huán)丙沙星、恩諾沙星)進(jìn)行了SERS檢測研究。修梓僑等[6]利用拉曼光譜分析法可以快速準(zhǔn)確地檢測出乙烯雌酚、甲狀腺素和地塞米松3種激素。本課題組在前期研究[7-9]中對鴨肉中的環(huán)丙沙星、萘夫西林、土霉素等抗生素殘留進(jìn)行了拉曼光譜檢測的定性和定量分析，由于檢測的抗生素對象不同，且構(gòu)成的檢測體系也不一樣，導(dǎo)致檢測不同抗生素的拉曼光譜檢測的最優(yōu)條件也不一樣，因此，有必要對檢測鴨肉中DES殘留的拉曼光譜檢測最優(yōu)條件(檸檬酸三鈉、納米金膠、含DES的鴨肉提取液、硫酸鎂溶液的加入量以及拉曼光譜的采集時間)進(jìn)行優(yōu)化。目前還未見有關(guān)基于SERS技術(shù)的鴨肉中DES殘留快速檢測的研究報道。基于此，本研究擬探索鴨肉中DES殘留的SERS快速檢測的可行性，為鴨肉中的激素殘留檢測提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

麻鴨：江西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)貿(mào)市場；

DES標(biāo)準(zhǔn)品：純度約99%，南昌精科科學(xué)儀器有限公司；

三水合氯金酸：金含量≥49.0%，西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司；

二水合檸檬酸三鈉、乙腈、無水甲醇、硫酸鎂、正己烷等：分析純，南昌精科科學(xué)儀器有限公司。

1.2 儀器設(shè)備

便攜式拉曼光譜檢測系統(tǒng)：包括QE 65000型拉曼光譜儀、785 nm 激光器、光纖和采樣附件等，美國海洋光學(xué)公司；

純水機：全自動RO型，美國Teledyne公司；

高速組織勻漿機：DS-1型，上海標(biāo)本模型廠；

電子天平：FA1004B型，上海上平儀器有限公司；

超聲波清洗器：JK-50B型，金尼克機械有限公司；

漩渦震蕩器：VORTEX-5型，其林貝爾儀器有限公司；

萬用電爐：單聯(lián)型，北京科偉永興儀器有限公司；

低速離心機：JW-1024型，嘉文儀器裝備有限公司；

石英進(jìn)樣瓶：直徑11.5 mm，高30 mm，北京瑞盛博源科技發(fā)展有限公司；

氮吹儀：HSC-24B型，恒奧科技發(fā)展有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 納米金膠的制備 取0.01% 氯金酸100 mL加入到150 mL燒杯中，放至萬用電磁爐上加熱至沸騰后，迅速加入一定量(0.6，0.8，0.9，1.0，1.2 mL)1%檸檬酸三鈉溶液，并不停攪拌9 min，冷卻至室溫后備用，共制得5種不同粒徑的納米金膠[10]。

1.3.2 DES標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 稱取約10 mg DES標(biāo)準(zhǔn)品，先用少量無水甲醇溶解，待超聲后，冷卻至室溫，再用無水甲醇定容至100 mL棕色容量瓶刻度線，即可得到100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。再將其用無水甲醇稀釋成一系列濃度DES標(biāo)準(zhǔn)品樣本溶液備用。

1.3.3 硫酸鎂溶液的制備 取1.204 g無水硫酸鎂至燒杯中，加入 100 mL的超純水，待充分溶解后轉(zhuǎn)移至棕色容量瓶，即可得到0.1 mol/L的硫酸鎂溶液。

1.3.4 鴨肉提取液的制備 稱取約5 g已勻漿好的鴨胸脯肉放入50 mL離心管中，加入10 mL無水甲醇，經(jīng)渦旋、超聲震蕩，4 200 r/min離心10 min，殘渣用無水甲醇再萃取1次。合并萃取液，在30 ℃下氮氣吹干，用4 mL乙腈溶解，加入8 mL正己烷，經(jīng)渦旋、超聲震蕩，于4 200 r/min 離心10 min，取乙腈相，于30 ℃水浴下氮氣吹干，繼續(xù)使用乙腈和正己烷重復(fù)去脂提取1次，氮氣吹干后加入10 mL的無水甲醇，經(jīng)0.25 μm有機系微孔膜過濾后得到空白鴨肉提取液備用[11]。稱取約10 mg DES標(biāo)準(zhǔn)品，用鴨肉提取液定容至100 mL即為含100 mg/L DES的鴨肉提取液。將含100 mg/L DES的鴨肉提取液用空白鴨肉提取液稀釋即可得含不同濃度DES的鴨肉提取液。

1.3.5 檢測條件的優(yōu)化 調(diào)節(jié)1%檸檬酸三鈉的加入量分別為0.6，0.8，0.9，1.0，1.2 mL，制得5種不同粒徑的納米金膠，來確定適合本研究的納米金膠的最優(yōu)粒徑。再加入500 μL 納米金膠、5 μL含DES的鴨肉提取液(8 mg/L)和70 μL 硫酸鎂溶液(0.1 mol/L)，確定檸檬酸三鈉的最佳加入量。用不同體積(300，500，700，900，1 100 μL)的納米金膠分別與5 μL的含DES的鴨肉提取液(8 mg/L)和70 μL 的硫酸鎂溶液(0.1 mol/L)混合，來確定納米金膠最優(yōu)加入量。試驗中固定加入500 μL納米金膠與70 μL硫酸鎂(0.1 mol/L)，改變含DES的鴨肉提取液(8 mg/L)的加入量(3，5，10，15，20 μL)，來確定含DES的鴨肉提取液最優(yōu)加入量。固定加入500 μL納米金膠和5 μL含DES的鴨肉提取液(8 mg/L)，再分別加入不同量(30，50，70，100，120，150 μL)的硫酸鎂溶液(0.1 mol/L)，來確定硫酸鎂溶液的最優(yōu)加入量。以加入納米金膠500 μL，含DES的鴨肉提取液(8 mg/L) 5 μL，硫酸鎂溶液(0.1 mol/L)70 μL，經(jīng)反應(yīng)時間0，1，5，10，15，20 min后，來確定最優(yōu)反應(yīng)時間。

1.3.6 光譜測量與數(shù)據(jù)分析方法 將500 μL納米金膠、5 μL 含DES的鴨肉提取液和70 μL硫酸鎂溶液依次加入到2 mL石英瓶中進(jìn)行振蕩以充分混合，1 min后將其放入樣品池中進(jìn)行拉曼光譜的采集。相關(guān)儀器參數(shù)設(shè)置如下：500 mW 的激光器的激光發(fā)射功率，分辨率6 cm-1，積分時間10 s，積分平均2次，平滑度為1，并選取掃描光譜波段為400～1 800 cm-1進(jìn)行研究。每個濃度做5個平行樣，并以其平均拉曼光譜作為該濃度樣本的拉曼光譜進(jìn)行分析。根據(jù)819 cm-1處的拉曼強度，采用單因素分析法對試驗條件進(jìn)行優(yōu)化。用819 cm-1處特征峰峰強建立預(yù)測鴨肉提取液中DES含量(0.5～13.0 mg/L)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并對含不同DES濃度(2.0，5.0，8.0，10.0，12.0 mg/L)的鴨肉提取液樣本進(jìn)行回收率試驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 鴨肉中DES的SERS分析

圖1中的曲線a～e分別表示納米金膠+硫酸鎂(0.1 mol/L)、甲醇、鴨肉提取液、DES標(biāo)準(zhǔn)品(8 mg/L)和含DES的鴨肉提取液(8 mg/L)的SERS光譜。由曲線c與曲線e對比可知，在曲線e中585，819，895，1 073，1 091 cm-1處出現(xiàn)比較明顯的特征峰，而在曲線b上，585，895 cm-1處出現(xiàn)比較弱的峰，由此考慮將819，1 073，1 091 cm-1處特征峰定為DES的拉曼特征峰，可能是鴨肉提取液中成分較復(fù)雜，影響了DES標(biāo)準(zhǔn)品溶液的一些分子基團(tuán)性質(zhì)，使585，895 cm-1處特征峰被覆蓋。為進(jìn)一步確定DES拉曼特征峰位置，將曲線d與曲線b進(jìn)行對比，在DES標(biāo)準(zhǔn)品SERS曲線d中，上述3個拉曼位移(819，1 073，1 091 cm-1)處也能得到與曲線e相同的特征峰，并且同在819 cm-1拉曼位移處特征峰峰值最高，因此本研究將819 cm-1處的峰作為后續(xù)檢測鴨肉中DES殘留量的最佳拉曼特征峰。將曲線d和曲線a對比可知，納米金膠和硫酸鎂作為增強基底，測得的DES標(biāo)準(zhǔn)品的拉曼光譜，具有特征峰數(shù)量增多，峰值強度提高的特點，證明納米金膠和硫酸鎂增強基底對DES標(biāo)準(zhǔn)品的拉曼峰有著不錯的增強效果。

2.2 不同粒徑納米金膠對拉曼光譜的影響

不同檸檬酸三鈉還原劑的加入量可以制得不同粒徑的納米金膠，進(jìn)而對拉曼光譜的增強效果產(chǎn)生影響[12]。以不同粒徑納米金膠制備所需的檸檬酸三鈉加入量為橫坐標(biāo)，特征峰819 cm-1處的峰值強度為縱坐標(biāo)繪制圖2?？煽闯鲭S著檸檬酸三鈉加入量的增加，819 cm-1處的峰值強度呈先上升后下降的趨勢，在其加入量為0.9 mL時，對應(yīng)的峰值強度最高，證明了不同粒徑納米金膠對DES的鴨肉提取液的拉曼光譜有著緊密的關(guān)系。因檸檬酸三鈉加入量為0.9 mL時峰值最強，所以，在后續(xù)試驗中均采用檸檬酸三鈉還原劑加入量為0.9 mL制備金膠。

a. 納米金膠+硫酸鎂 b. 甲醇 c. 鴨肉提取液 d. DES標(biāo)準(zhǔn)品(8 mg/L) e. 含DES的鴨肉提取液(8 mg/L)

圖1 不同樣品的SERS光譜

Figure 1 SERS spectra of different samples

圖2 檸檬酸三鈉加入量對含DES的鴨肉提取液(8 mg/L)的SERS強度的影響

Figure 2 Effect of the amount of the sodium citrate on SERS intensities of duck meat extract containing DES (8 mg/L)

2.3 納米金膠加入量對SERS信號的影響

本研究中自制的納米金膠是鴨肉中DES能產(chǎn)生SERS效應(yīng)的必需條件。因此，有必要考察金膠的加入量對SERS信號強度的影響。圖3為加入不同量納米金膠時，在819 cm-1拉曼位移處的SERS信號強度隨金膠加入量變化的趨勢圖。從圖3可看出，拉曼散射強度隨著納米金膠加入量的增大，呈先增后減再增最后減的趨勢，但在納米金膠加入量為500 μL時拉曼散射強度達(dá)到最高。因此，在后續(xù)試驗納米金膠加入量都建立在500 μL的基礎(chǔ)上進(jìn)行分析。納米金膠加入量為900 μL時的拉曼強度比納米金膠加入量為700 μL時增加的原因可能是鴨肉提取溶液中的DES分子和其他成分分子與納米金膠顆粒發(fā)生競爭性吸附，此時有更多的DES分子吸附在納米金膠顆粒表面。

圖3 金膠加入量對含DES的鴨肉提取液(8 mg/L)的SERS強度的影響

Figure 3 Effect of the addition amount of the Au nanoparticles on SERS intensities of duck meat extract containing DES (8 mg/L)

2.4 待測液加入量對SERS信號的影響

在入射光照條件下，金膠納米粒子中電子與鴨肉提取液中的分子產(chǎn)生等離子體共振進(jìn)而產(chǎn)生SERS效應(yīng)[12-13]。由圖4可以發(fā)現(xiàn)，819 cm-1處的拉曼特征峰峰強與含DES的鴨肉提取液加入量存在密切關(guān)系，其峰強在含DES的鴨肉提取液加入量為3～5 μL時呈上升趨勢，可能是待測液的增加，導(dǎo)致DES分子數(shù)量增多，從而增大了DES分子吸附在納米金膠活性位置上的概率。在加入量超過5 μL時拉曼特征峰強度下降到較低值，可能是過量的含DES的鴨肉提取液會導(dǎo)致納米金膠、含DES的鴨肉提取液和硫酸鎂溶液的混合液中一些蛋白質(zhì)和脂肪雜質(zhì)的增多，影響了DES分子與納米金膠的吸附。故最佳待測液的加入量為5 μL。

圖4 含DES的鴨肉提取液加入量對含DES的鴨肉提取液(8 mg/L)的SERS強度的影響

Figure 4 Effect of the addition amount of the duck meat extract containing DES on SERS intensities of duck meat extract containing DES (8 mg/L)

2.5 硫酸鎂溶液加入量對SERS信號的影響

鴨肉提取液中的DES分子如僅僅在本研究中金納米顆粒的吸附作用下，產(chǎn)生的拉曼信號非常弱，必須在活化劑存在的條件下才能夠得到明顯的增強，可能是活化劑分子對金納米顆粒有誘導(dǎo)和活化效果，可增強鴨肉提取液中分子與基底之間的凝聚程度，進(jìn)而影響電磁場的增強，從而增強鴨肉提取液中分子的SERS[13]。本研究以硫酸鎂溶液為活化劑，來改變金納米粒子的凝聚狀態(tài)。圖5為硫酸鎂加入量對819 cm-1處特征峰峰強的影響。根據(jù)圖5可發(fā)現(xiàn)，當(dāng)硫酸鎂溶液的體積<70 μL時，819 cm-1處的拉曼強度逐漸升高。這可能是少量的硫酸

圖5 硫酸鎂溶液加入量對含DES的鴨肉提取液(8 mg/L)的SERS強度的影響

Figure 5 Effect of the addition amount of the MgSO4solution on SERS intensities of duck meat extract containing DES (8 mg/L)

鎂溶液可增強鴨肉提取液中的DES分子與金納米顆粒的凝聚狀態(tài)，從而增強DES分子在819 cm-1處的拉曼信號強度。當(dāng)硫酸鎂溶液的體積>70 μL且≤150 μL時，過量的硫酸鎂分子可能引起了金納米顆粒的聚沉，反而降低了DES分子在819 cm-1處的拉曼信號強度。150 μL時的拉曼強度比120 μL時的增加可能是由競爭性吸附效應(yīng)引起的，此時有更多的DES分子吸附在納米金膠顆粒表面?；诖?，將硫酸鎂溶液(0.1 mol/L)的最佳加入量定為70 μL。

2.6 反應(yīng)時間對SERS信號的影響

研究[14]發(fā)現(xiàn)在表面增強拉曼散射中，會出現(xiàn)一些納米粒子聚集點(稱為“熱點”)，能使吸附在上面的樣品分子或官能團(tuán)的光散射強度得到最高可達(dá)106倍的增強；過長的吸附反應(yīng)時間，可能會使金納米粒子產(chǎn)生聚沉，減少熱點數(shù)目，降低拉曼光譜強度。對所采集數(shù)據(jù)進(jìn)行air-PLS處理，再以吸附時間為橫坐標(biāo)，819 cm-1處特征峰峰強為縱坐標(biāo)建立關(guān)系曲線。如圖6所示，隨著時間的延長，拉曼特征峰強度先急劇下降后緩慢降低，雖然吸附0 min 時的特征峰強度最高，但因0 min的吸附反應(yīng)時間操作較困難，例如，納米金膠、含丙酸睪酮的鴨肉提取液和硫酸鎂溶液需多人同時且快速加入同一2 mL石英進(jìn)樣瓶中，易引起操作誤差，故在試驗中均選擇1 min采集拉曼光譜。

2.7 鴨肉中DES的SERS定量分析

對采集到的鴨肉提取液中含不同DES 濃度(0.5，1.0，3.0，4.0，6.0，7.0，9.0，11.0，13.0 mg/L)的樣本SERS光譜進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)隨著DES濃度的增加，819 cm-1拉曼位移處的特征峰峰強也在隨之增高。因此，將819 cm-1拉曼位移處的特征峰強度為依據(jù)對鴨肉中DES的含量進(jìn)行定量分析。

圖6 吸附時間對含DES的鴨肉提取液(8 mg/L)的SERS強度的影響

Figure 6 Effect of the adsorption time on SERS intensities of duck meat extract containing DES (8 mg/L)

分析含不同DES濃度(0.5～13.0 mg/L)的鴨肉提取液樣本的拉曼光譜強度，繪制出鴨肉提取液中DES濃度與各DES濃度在819 cm-1處特征峰峰強的關(guān)系曲線如圖7(a)所示，橫坐標(biāo)為鴨肉提取液中DES殘留的濃度，縱坐標(biāo)為819 cm-1拉曼位移處的特征峰強度。由圖7可知，鴨肉提取液中DES濃度在0.5～13.0 mg/L時，與819 cm-1處特征峰強度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，其線性方程為：y=185.81x+1 260，決定系數(shù)(R2)為0.942 4。為進(jìn)一步做預(yù)測分析，驗證該方法的可靠性，對含不同DES濃度(2，5，8，10，12 mg/L)的鴨肉提取液樣本進(jìn)行回收率試驗。圖7(b)給出了預(yù)測集樣本中DES含量的實際值與預(yù)測值之間的關(guān)系，它們之間的R2為0.969 0，預(yù)測均方根誤差(RMSEP)為0.728 1 mg/L。對預(yù)測樣本進(jìn)行回收率試驗，樣本回收率為83%～133% (表1)。試驗結(jié)果表明，基于本研究自制增強基底的SERS技術(shù)應(yīng)用于快速檢測鴨肉中DES殘留量是可行的，在現(xiàn)場檢測中有較好的推廣使用價值。

3 結(jié)論

本研究建立了一種鴨肉中DES殘留的拉曼光譜快速檢測方法。對檢測鴨肉中DES殘留的最優(yōu)檢測條件進(jìn)行了分析，得到納米金膠、含DES的鴨肉提取液、硫酸鎂溶液的最優(yōu)加入量分別為500，5，70 μL，較優(yōu)的測試時間為1 min。在此研究基礎(chǔ)上，以鴨肉提取液中DES濃度與819 cm-1處特征峰峰強建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，最低檢測濃度可達(dá)到0.5 mg/L。進(jìn)一步做預(yù)測分析，預(yù)測集R2為0.969 0，RMSEP為0.728 1 mg/L，平均回收率為83%～133%。本方法的樣本前處理簡單快速，較好地滿足了鴨肉中DES殘留快速檢測要求，有較好的應(yīng)用前景。但本方法只能檢測鴨肉中的一種抗生素DES殘留，在后期的研究中，可探索不同種納米增強膠體或樣本前處理方法對鴨肉中多種抗生素殘留進(jìn)行SERS多殘留檢測的可能性。

表1 含DES的鴨肉提取液加標(biāo)樣本回收率

圖7 鴨肉中DES的SERS定量分析結(jié)果

Figure 7 SERS quantitative analysis results for samples of duck meat extract containing DES