馬雪婷 張九凱 陳 穎 梁金鐘王 楠 馬秀麗 郭波莉

(1. 哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150076；2. 中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，北京 100176；3. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京 100193)

商品燕窩(Edible bird’s nest, EBN)本質(zhì)上是雨燕科產(chǎn)燕窩的金絲燕(Aerodramus屬)舌下腺分泌的唾液固化后形成于燕屋或天然洞穴峭壁的一種高值動(dòng)物源性滋補(bǔ)品[1]。前人[2]54-60研究發(fā)現(xiàn)，質(zhì)量上乘的官燕燕盞是由爪哇金絲燕(Aerodramusfuciphagus)及其亞種淡腰金絲燕(Aerodramusfuciphagusgermani)生產(chǎn)的，而且燕屋的開發(fā)利用極大地提高了官燕的產(chǎn)量，可以說目前市場上絕大多數(shù)的官燕都是采自人造燕屋的屋燕(House EBN 或 Farmed EBN)。對于采自天然洞穴巖壁的洞燕來說，其物種來源不僅包括爪哇金絲燕還包括生產(chǎn)毛燕的大金絲燕(Aerodramusmaximus)及其亞種(Aerodramusmaximuslowi)和生產(chǎn)草燕的白腹金絲燕(Collocaliaesculenta)[2]4-7[3-4]。

燕窩自古就被冠上了滋補(bǔ)品的標(biāo)簽，其中表皮生長因子[5]、唾液酸、人體必需氨基酸、礦質(zhì)元素、維生素B1、牛磺酸[5]、糖蛋白等成分的發(fā)現(xiàn)很好地詮釋了燕窩諸多的生物功效，如促進(jìn)表皮生長[6]、滋陰養(yǎng)肺、化痰止咳、抗氧化[7]、抗病毒[8]、延緩衰老[9]、保護(hù)軟骨組織等[10]。據(jù)統(tǒng)計(jì)[11]，2016年中國大陸燕窩年消費(fèi)量達(dá)500 t，年銷售額達(dá)200億元人民幣，且中國流通領(lǐng)域的燕窩幾乎全部進(jìn)口于燕窩最大的兩個(gè)出口國：印度尼西亞和馬來西亞。鑒于燕窩禽類制品的特殊性以及消費(fèi)者對燕窩真實(shí)信息所享有的知情權(quán)，燕窩溯源技術(shù)研究的開展可以從根本上解決燕窩來源的鑒別問題，從而可以杜絕燕窩標(biāo)簽的不實(shí)宣傳，同時(shí)為流通領(lǐng)域燕窩的召回提供技術(shù)支撐。針對燕窩中營養(yǎng)成分，有學(xué)者[12-13]開展了燕窩中礦質(zhì)元素分析研究，并取得了一些進(jìn)展。Marcone[14]發(fā)現(xiàn)燕窩中含有2.1%的灰分并應(yīng)用原子吸收技術(shù)在燕窩中發(fā)現(xiàn)了重要的營養(yǎng)元素K、Ca、Mg、Fe，其中白燕窩含有較高的Ca而紅燕窩含有較高的Fe。隨著電感耦合等離子體技術(shù)的出現(xiàn)，電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(ICP-OES)和ICP-MS先后被應(yīng)用于燕窩中多種元素的分析，發(fā)現(xiàn)燕窩普遍含有較高含量的K、Na、Ca、Mg 4種常量元素和Fe、Cu、Zn、Mn、Cr等多種微量元素[15-17]。趙斌等[18]利用ICP-MS技術(shù)對燕窩中20種元素進(jìn)行了聚類分析，發(fā)現(xiàn)這20種元素在紅、白、黃燕窩之間的差異并不顯著。Seow等[19]利用燕窩中的K、Na、Ca、Mg的分布情況實(shí)現(xiàn)了對24個(gè)馬來半島屋燕和24個(gè)洞燕(采自東馬來和蘇門答臘島)100%鑒別。然而，還未有利用多元素分布情況對燕窩產(chǎn)地及采收溯源信息進(jìn)行系統(tǒng)、詳實(shí)的研究報(bào)道。為此，本研究擬以馬來西亞和印度尼西亞的屋燕和洞燕為研究對象，采用ICP-MS技術(shù)對燕盞中多種元素的分布進(jìn)行分析，并結(jié)合燕窩產(chǎn)地、采收方式相關(guān)的背景信息對具有溯源特性的數(shù)據(jù)進(jìn)行挖掘，以期篩選出對進(jìn)口燕窩產(chǎn)地及采收方式溯源具有指導(dǎo)意義的變量，為實(shí)現(xiàn)基于元素分析和化學(xué)計(jì)量學(xué)模型的燕窩溯源及營養(yǎng)功能開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

本研究搜集了24個(gè)馬來西亞燕盞和24個(gè)印度尼西亞燕盞，其中屋燕燕盞34個(gè)，洞燕燕盞14個(gè)(由中國城市農(nóng)貿(mào)中心聯(lián)合會(huì)燕窩市場專業(yè)委員會(huì)、中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院HACCP中心提供)。參照王鳳云等[3]報(bào)道的DNA條碼方法對所有燕盞樣品的物種來源進(jìn)行了鑒定，物種來源均為爪哇金絲燕Aerodramusfuciphagus。

硝酸：MOS級，北京化學(xué)試劑研究所；

雙氧水：分析純，北京化學(xué)試劑研究所；

ICP-MS內(nèi)標(biāo)樣品(1 ng/L，part#5183-4680)：美國Agilent公司；

GBW(E)080684大米粉成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(ICP-MS)：7700型，美國Agilent公司；

微波消解儀：MARS 5型，美國CEM公司；

純水機(jī)：Mill-Q型，美國Millipore公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品消解 在樣品消解前，每個(gè)樣品取約1 g置于烘箱中(60 ℃)烘至恒重(約15 h)，取出放涼置于干燥器中密封保存。參照Zhang等[20]的消解方法，準(zhǔn)確稱取0.25 g 樣品于消解管中，加入6 mL硝酸浸泡2 h后，加入2 mL 雙氧水浸泡0.5 h。在1 600 W功率下將微波消解儀以15 ℃/min 上升到120 ℃并保持2 min后，以8 ℃/min 上升到160 ℃并保持5 min，再以4 ℃/min上升到180 ℃并保持15 min。冷卻20 min后，用去離子水將消解管中的樣品轉(zhuǎn)移至酸浸泡過的聚乙烯瓶中并定容至100 mL，待分析。

1.2.2 元素分析方法 以72Ge、115In和209Bi為內(nèi)標(biāo)，利用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(ICP-MS)的在線內(nèi)標(biāo)法對不同來源燕窩中的B、Na、Mg、Al、P、K、Ca、V、Cr、Mn、Fe、Co、Cu、Zn、Se、Rb、Sr、Mo、Cs、Ba、La、Ce、Nd、Tb、Lu、Pt、Pb 27種元素進(jìn)行分析。采用外標(biāo)法對27種元素進(jìn)行定量，當(dāng)內(nèi)標(biāo)元素的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差>5%時(shí)需要重新測定。同時(shí)以GBW(E)080684大米粉成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為參考標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對操作全過程進(jìn)行質(zhì)控。ICP-MS參數(shù)：入射功率1 280 W；冷卻氣流速1.47 L/min；霧化室溫度2 ℃；載氣(氬氣)流速和輔助氣流速均為1 L/min；采樣深度8 mm。

1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析方法 利用IBM SPSS Statistics Version 20軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行頻率分析、Shapiro-Wilk檢驗(yàn)、t-檢驗(yàn)、Mann-Whitney U檢驗(yàn)、雙因素方差分析、Pearson相關(guān)分析和Spearman相關(guān)分析等統(tǒng)計(jì)分析。采用比率分析對各元素的中位居中變異系數(shù)(COV)進(jìn)行計(jì)算，分母為設(shè)置的新變量K=1。

2 結(jié)果與分析

2.1 燕窩中元素分布

首先利用Shapiro-Wilk檢驗(yàn)對27種元素分布的正態(tài)性進(jìn)行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Pt元素在燕窩中呈正態(tài)分布，其他元素呈偏態(tài)分布(表1)，因此分別以均值和中位數(shù)對Pt及其它26種元素的分布進(jìn)行描述。由27種元素的含量可以看出，燕窩中富含K、Na、Ca、Mg、Fe、Al、P、Cu等多種礦質(zhì)元素，其中含量最高的前5個(gè)元素均為人體必需的大量元素且含量由高到低的順序?yàn)镹a>Ca>Mg>K>P，通過比較發(fā)現(xiàn)這個(gè)規(guī)律與多數(shù)前人[12-13,15,18]研究結(jié)果一致。根據(jù)這5個(gè)常量元素的Pearson相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，燕盞中Ca含量與Na含量極顯著負(fù)相關(guān)(-0.742，雙側(cè)P<0.01)，同時(shí)Ca含量又與Mg含量極顯著正相關(guān)(0.754，雙側(cè)P<0.01)，P與其他4個(gè)元素均不相關(guān)。這就說明對于獨(dú)立的燕盞個(gè)體來說，Ca與Na的含量高低順序可能會(huì)發(fā)生變化，這一規(guī)律在他人[14,21-22]的研究中也是得到證實(shí)的，Ca與Mg的含量高低順序不會(huì)改變。在燕窩中含有的生物體必需微量元素如Fe、Cu、Zn、Mn、Mo、Co、Se、Cr中，F(xiàn)e的含量通常最高。除此之外，在燕窩中還發(fā)現(xiàn)了5種稀土元素，其中3種痕量的輕稀土La、Ce、Nd(<0.02 μg/g)和微量的重稀土Tb、Lu(<2 μg/g)。利用SPSS 20.0對27種元素在不同來源燕窩中分布的中位居中變異系數(shù)(Coefficient of Variance，COV)進(jìn)行了分析，Sr、Ce、Cr、Fe、La、Al、Ba、V、Pb等元素在燕窩中的COV均>400%，其中Sr的最大達(dá)到了2 142%，說明一些重要的因素可能對元素在不同來源燕盞樣品間的分布造成了影響。

2.2 不同來源燕窩中多元素差異分布原因分析

2.2.1 產(chǎn)地 本研究僅對燕窩的2個(gè)主要產(chǎn)地印度尼西亞和馬來西亞進(jìn)行研究。根據(jù)Shapiro-Wilk檢驗(yàn)和Leneve齊質(zhì)性檢驗(yàn)結(jié)果，不同產(chǎn)地燕窩中僅Pt呈正態(tài)分布且方差齊性，其他元素呈非正態(tài)分布，因此以產(chǎn)地為分組變量分別采用t-檢驗(yàn)和Mann-Whitney U檢驗(yàn)對不同產(chǎn)地燕窩中Pt及其他26種元素的差異顯著性進(jìn)行分析。在燕窩產(chǎn)地間具有顯著性差異的9個(gè)元素中，印度尼西亞燕窩中的Al、V、Mo、Ba、Co等元素顯著高于馬來西亞燕窩，而馬來西亞燕窩中的Mg、Pt、Ca、Lu等元素則顯著高于印度尼西亞燕窩(表2)。根據(jù)Spearman相關(guān)分析結(jié)果，燕盞中Pt、Al、Mg、Mo等元素與產(chǎn)地的相關(guān)系數(shù)相對較高(≥0.4)，說明這4種元素與產(chǎn)地的關(guān)聯(lián)程度是相對緊密的。

表1 燕窩中27種元素分布情況?

? Pt元素以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，其他的元素均以中位數(shù)(Q1，Q3)表示；數(shù)據(jù)取舍原則：≥1 000的數(shù)據(jù)按照四舍五入原則保留整數(shù)部分，介于1與1 000之間的數(shù)據(jù)按照四舍五入原則取4位有效數(shù)字，<1的數(shù)據(jù)保留小數(shù)點(diǎn)后4位。

2.2.2 采收方式 燕窩的采收方式包括從人造燕屋采摘和從天然洞穴采摘2種，采自燕屋稱為屋燕，采自天然山洞的稱為洞燕[23]。根據(jù)Shapiro-Wilk檢驗(yàn)和Leneve齊質(zhì)性檢驗(yàn)結(jié)果，屋燕和洞燕中僅Pt呈正態(tài)分布且方差齊性，其他元素呈非正態(tài)分布，因此以采收方式為分組變量分別采用t-檢驗(yàn)和Mann-Whitney U檢驗(yàn)對不同產(chǎn)地燕窩中Pt及其他26種元素的差異顯著性進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，屋燕和洞燕中的Rb、Cs、Tb元素含量沒有顯著差別，因此本研究挖掘了24種不同采收方式燕窩間具有顯著差異的元素(表3)，其中：洞燕中的B、Mg、Al、P、K、Ca、V、Cr、Mn、Fe、Co、Zn、Sr、Mo、Ba、La、Ce、Nd、Pb等元素的含量顯著高于屋燕；屋燕中的Na、Cu、Se、Lu、Pt等元素的含量則顯著高于洞燕。天然山洞中可能含有較多的浸礦細(xì)菌如硫桿菌屬細(xì)菌、氧化亞鐵鐵桿菌、氧化亞鐵微螺桿菌等[24]，繁殖的過程中產(chǎn)生了酸等將天然山洞巖壁中的礦質(zhì)元素浸提出來，金絲燕將燕窩筑在浸出元素的巖壁上，從而導(dǎo)致洞燕中含有多種含量較高的元素。Seow等[19]對比了屋燕與洞燕中K、Ca、Na、Mg的含量，在洞燕中發(fā)現(xiàn)較高含量的Ca，在屋燕中也發(fā)現(xiàn)了較高含量的Na，與本研究的結(jié)果一致。同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)洞燕中的3個(gè)輕稀土元素La、Ce、Nd的含量也顯著高于屋燕。這些輕稀土可能被森林植被富集或過度富集進(jìn)入到爪哇金絲燕的食物鏈[25]，經(jīng)由昆蟲榕小蜂、飛蟻和蜉蝣等昆蟲進(jìn)入到爪哇金絲燕體內(nèi)[26]。

2.2.3 產(chǎn)地×采收方式交互作用 對于離散型數(shù)據(jù)，首先將除Pt外的其他26個(gè)元素按照Tukey法計(jì)算正態(tài)得分后進(jìn)行排序，然后采用一般線性模型進(jìn)行全因子分析對個(gè)案排秩后的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，分別對產(chǎn)地與采收方式2個(gè)主效應(yīng)及二者的交互作用對不同來源燕窩中元素分布的影響因素進(jìn)行探索。根據(jù)燕窩中元素分布的全因子分析結(jié)果(表4)，Se和Pb的校正模型不顯著，不能考察產(chǎn)地×采收方式交互作用對二者的影響。為了避免因多次比較造成一類錯(cuò)誤概率的增加，在本研究中將顯著性水平0.05除以因變量的數(shù)目27即為0.001，也就是說只有P<0.001才認(rèn)為差異是顯著的。在此水平下：燕窩中B、Na、P、Ca、Mn、Cu、Sr、Mo、Ba、Nd等10個(gè)元素只受采收方式主效應(yīng)的影響，與產(chǎn)地?zé)o關(guān)，Seow等[19]與也認(rèn)為Ca和Na與燕窩的采收方式密切相關(guān)；Mg、Al、Zn、Lu、Pt等同時(shí)受產(chǎn)地和采收方式主效應(yīng)的影響，但交互作用的影響不顯著。對于受產(chǎn)地×采收方式交互作用顯著影響的元素K、V、Cr、Co、Cs、La、Ce來說，除了Cs以外，其他6個(gè)元素同時(shí)還受采收方式主效應(yīng)的顯著影響，也就是說采收方式對這6個(gè)元素在燕窩中分布的影響在2個(gè)產(chǎn)地間是不同的。但是，燕窩中的Fe、Rb、Tb既不受主效應(yīng)的顯著影響又不受交互作用的顯著影響。由判決系數(shù)可知，產(chǎn)地、采收方式以及二者的交互作用能夠解釋各自變異40%的只有Sr、V、Ca、Na、Pt、Al、Mg 7個(gè)元素，即其他元素至少有60%以上的變異是由其他因素造成的，可能包括金絲燕的食物來源、生存環(huán)境以及樣品收集過程等因素。

表2 不同產(chǎn)地燕窩間顯著性差異元素?

? Pt以“均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，其他的元素均以“中位數(shù)(四分位數(shù)間距)”表示；*表示2個(gè)產(chǎn)地燕窩中的該元素含量存在顯著性差異(P<0.05)，**表示2個(gè)產(chǎn)地燕窩中的該元素的含量存在極顯著性差異(P<0.01)。

表3 不同采收方式燕窩間顯著性差異元素?

? Pt和Mg以“均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，其他的元素均以“中位數(shù)(四分位數(shù)間距)”表示；*表示2個(gè)產(chǎn)地燕窩中的該元素含量存在顯著性差異(P<0.05)，**表示2個(gè)產(chǎn)地燕窩中的該元素的含量存在極顯著性差異(P<0.01)。

3 結(jié)論

燕窩中含有豐富的礦質(zhì)元素和痕量的稀土元素，且絕大多數(shù)元素呈偏態(tài)分布、變異系數(shù)較大。從產(chǎn)地和采收方式以及二者的交互作用等方面對不同來源燕窩中多元素差異分布的原因進(jìn)行分析，篩選出馬來西亞和印度尼西亞產(chǎn)的燕窩間具有顯著差異的Mg、Al、Pt等元素，以及屋燕和洞燕間具有顯著差異的B、Na、P、Ca、Mn、Cu、Sr、Mo、Ba、Nd等元素。由此可知，基于多元素分析的燕窩產(chǎn)地及采收方式溯源是可行的。為此，在后續(xù)的研究中，將利用化學(xué)計(jì)量學(xué)技術(shù)基于差異多元素構(gòu)建燕窩產(chǎn)地及采收方式溯源模型，并收集更多的不同來源燕窩樣品以檢驗(yàn)?zāi)Ｐ偷念A(yù)測準(zhǔn)確性，解決燕窩的溯源問題，為燕窩真?zhèn)舞b別技術(shù)體系的構(gòu)建提供技術(shù)儲備。

表4 燕窩中元素分布的全因子分析

誠摯感謝中國城市農(nóng)貿(mào)中心聯(lián)合會(huì)燕窩市場專業(yè)委員會(huì)和中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院HACCP中心的孫利副研究員在燕窩樣品收集方面給予的莫大幫助。