劉小燕 周紅麗

(1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，湖南 長沙 410218；2. 食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410218)

果酒是指以新鮮的水果或果汁為原料，經(jīng)發(fā)酵而成的酒精度較低的發(fā)酵酒[1]，具有水果的風(fēng)味和多種營養(yǎng)成分[2]。一般果酒的酒精含量在5%～10%，稍微高的酒精含量在14%左右[1，3]。水果的種類繁多，所以果酒風(fēng)格各異。

發(fā)酵菌種的選育對果酒品質(zhì)至關(guān)重要，中國果酒企業(yè)大都選擇純釀酒酵母，目前市場上果酒類發(fā)酵菌種主要以一些葡萄酒專用菌種和蘋果酒專用菌種為主，其他品種的果酒發(fā)酵專用菌種尚未形成[3]。純釀酒酵母生產(chǎn)的果酒雖然具有一定的果酒風(fēng)味，但沒有鮮明的個(gè)性特點(diǎn)。

本課題組從不同種類刺葡萄表皮上分離到一株高產(chǎn)乙醇的香坊腸桿菌，該菌能耐高酒精度，且香味獨(dú)特濃郁。Chun[4]、徐賽男[5]、陳夢娟[6]和Jones[7]分別從黑龍江傳統(tǒng)酸面團(tuán)、浙東腌冬瓜、刺葡萄表皮和甘蔗渣中分離出香坊腸桿菌并對其生理生化特性進(jìn)行了研究，但其發(fā)酵產(chǎn)生的香氣成分尚未進(jìn)行研究報(bào)道。本試驗(yàn)擬分別以蘋果和梨子為原料制作發(fā)酵果酒，對其發(fā)酵過程進(jìn)行跟蹤檢測，利用頂空固相微萃取—?dú)庀嗌V—質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析(SPME-GC-MS)檢測其香氣成分，對比香坊腸桿菌發(fā)酵和安琪酵母菌發(fā)酵果酒產(chǎn)生的香氣物質(zhì)的異同，旨在探明其香氣成分的種類和含量，為其能應(yīng)用于果酒釀造提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮蘋果和梨子：購自東之源超市；

香坊腸桿菌：實(shí)驗(yàn)室分離保藏；

酵母菌：安琪酵母有限公司；

偏重亞硫酸鈉：分析純，天津市化學(xué)試劑研究所；

葡萄糖：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

果膠酶：酶活≥500 U/mg，上海瑞永生物科技有限公司；

氯化鈉：分析純，天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

磁力攪拌器：90型，上海滬西分析儀器廠有限公司；

氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀：GCMS-QP 2010型，島津企業(yè)管理(中國)有限公司；

高壓滅菌鍋：LMQC型，山東新華醫(yī)療器械股份有限公司；

恒溫培養(yǎng)箱：ZQPL-200型，天津市萊玻特瑞儀器設(shè)備有限公司。

1.3 試驗(yàn)方案

1.3.1 香坊腸桿菌發(fā)酵過程中香氣成分跟蹤檢測 分別以蘋果和梨子為原料接種香坊腸桿菌發(fā)酵果酒，前發(fā)酵第3,7天分別取樣進(jìn)行SPME-GC-MS分析，后發(fā)酵每隔7 d分別取樣進(jìn)行SPME-GC-MS分析，分析香氣成分變化。

果酒發(fā)酵：新鮮成熟的蘋果和梨子分別洗凈去皮去核切塊，按0.02%(質(zhì)量比)加入偏重亞硫酸鈉進(jìn)行硫處理、壓榨，按0.1%(質(zhì)量比)加入果膠酶處理2 h，調(diào)整糖度至24 °Bx，按3%(體積比)接種量接種活化好的香坊腸桿菌于28 ℃恒溫發(fā)酵，7 d后過濾繼續(xù)發(fā)酵至28 d。

1.3.2 香坊腸桿菌與安琪酵母發(fā)酵產(chǎn)生的的香氣物質(zhì)對比

分別以蘋果和梨子為原料接種3%(體積比)活化好的香坊腸桿菌發(fā)酵果酒，同時(shí)按3%(體積比)接種活化好的安琪酵母菌發(fā)酵進(jìn)行對照。第28天取樣進(jìn)行SPME-GC-MS分析，分析對比其香氣物質(zhì)。

1.4 分析方法

香氣物質(zhì)采用SPME-GC-MS進(jìn)行分析。

固相微萃取條件：移取1 mL去離子水和1 mL樣品于固相微萃取瓶中，加0.2 g氯化鈉，在45 ℃下平衡15 min，在45 ℃、磁力攪拌下萃取20 min，進(jìn)行氣質(zhì)分析，解析5 min。

氣相色譜條件：色譜柱：RTX-5MS；載氣：He；柱流量：1 mL/min，分流比30∶1，進(jìn)樣口溫度：250 ℃；升溫程序：40 ℃保持2 min；以2 ℃/min升溫至80 ℃，保持2 min；以5 ℃/min升溫至250 ℃，保持2 min。

質(zhì)譜分析條件：離子源：電子轟擊電離離子源(EI源)，檢測器電壓：1 500 V；離子源溫度：230 ℃，GC/MS連接域溫度：280 ℃；質(zhì)量掃描范圍：0～1 000m/z。

結(jié)果比對分析：化合物結(jié)果通過NIST 11s.lib標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖庫進(jìn)行比對[8-11]。

2 結(jié)果分析

2.1 香坊腸桿菌發(fā)酵過程中香氣成分跟蹤檢測

2.1.1 蘋果酒發(fā)酵過程中香氣物質(zhì)跟蹤檢測 由表1、2可知，香坊腸桿菌發(fā)酵蘋果酒檢測出的香氣物質(zhì)種類主要有醇類和酯類，分別占11.68%～45.77% 和40%～56%；其次為酸類、醛類、烷烴類和苯酚。含量較高的組分為3-甲基-1-丁醇、2-甲基丁醇、苯乙醇及乙酸苯乙酯、3-甲基丁基乙酸酯、2-甲基丁基乙酸酯、癸酸乙酯、辛酸乙酯、異丁酸等。在發(fā)酵第14天開始檢測出較高含量的庚醛，占12%，并隨時(shí)間穩(wěn)定上升；在發(fā)酵第28天檢測出2,4,5-三甲基-1,3-二氧戊環(huán)，含量占10.88%。

研究發(fā)現(xiàn)：主要香氣成分中苯乙醇具有清甜的玫瑰樣花香[11]，乙酸苯乙酯有甜蜜的香味[12]；苯乙醇及其酯類和低級脂肪酸構(gòu)成蘋果酒香氣的基本骨架，脂肪酸酯特別是2-甲基丁基乙酸酯賦予蘋果酒的蘋果香[13]；癸酸乙酯具有椰子香、葡萄酒香[14]，李記明等[15]研究認(rèn)為其能反映蘋果酒中微弱的水果香、脂肪香、刺激、苦澀等香氣特征；辛酸乙酯具有白蘭地酒香[16]；庚醛在肉制品中呈現(xiàn)不良風(fēng)味[17]，在茶葉中呈現(xiàn)青草氣[18]，但嵇海峰等[19]研究認(rèn)為庚醛香氣活性值低，即便含量顯著增加也不會對產(chǎn)品風(fēng)味造成較大影響。這些成分共同賦予果酒酒香、果香、花香、甜香、青草氣等香氣特征。

隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，香氣物質(zhì)整體更加豐富，醇類百分含量急速下降，從發(fā)酵第3天的45.77%降到發(fā)酵第28天的11.687%；酯類種類整體增加，百分含量先升后降。

2.1.2 梨子酒發(fā)酵過程中香氣物質(zhì)跟蹤檢測 由表3、4可知：香坊腸桿菌發(fā)酵梨子酒檢測出的香氣物質(zhì)種類主要有醇類和酯類，分別占15%～55%和35%～46.56%；其次為酸類、醛類、烷烴類、苯酚和極少量的酮。含量較高的組分為3-甲基-1-丁醇、2-甲基丁醇及乙酸苯乙酯、3-甲基丁基乙酸酯、2-甲基丁基乙酸酯、癸酸乙酯、異丁酸等。在發(fā)酵第14天開始檢測出較高含量的庚醛，占11.76%，并隨時(shí)間穩(wěn)定上升；在發(fā)酵第28天檢測出2,4,5-三甲基-1,3-二氧戊環(huán)，含量占8.52%。

隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，香氣物質(zhì)整體更加豐富，醇類的種類整體增加，但百分含量微升后急速下降，從發(fā)酵第7天的55.15%降到發(fā)酵第28天的15.87%；酯類種類整體增加，百分含量微下降，絕對含量變化有待進(jìn)一步研究。

2.2 香坊腸桿菌和安琪酵母菌發(fā)酵果酒的香氣物質(zhì)對比分析

2.2.1 發(fā)酵蘋果酒的香氣物質(zhì) 由圖1，表5可知，分別接種香坊腸桿菌(試驗(yàn)組)和安琪酵母菌(對照組)發(fā)酵蘋果酒檢測出的香氣物質(zhì)中，有20種相同香氣物質(zhì)，有9種從試驗(yàn)組檢測出而對照組未檢測出，有18種從對照組檢測出而試驗(yàn)組未檢測出。試驗(yàn)組總醇11.69%，總酯40.39%；對照組總醇24.78%，總酯51.93%。

從香坊腸桿菌發(fā)酵的蘋果酒中檢測出的主要香氣物質(zhì)有庚醛、2,4,5-三甲基-1,3-二氧戊環(huán)、癸酸乙酯、乙酸苯乙酯、乙縮醛、辛酸乙酯、異丁酸、3-甲基-1-丁醇、苯乙醇、2-甲基-2-乙基丙酸乙酯、3-甲基丁基乙酸酯等，這些香氣物質(zhì)賦予蘋果酒酒香、花香、果香、甜香、青草氣等香氣特征。

表1 蘋果酒香氣物質(zhì)隨時(shí)間的變化

表2 蘋果酒香氣物質(zhì)分類匯總表

表3 梨子酒香氣物質(zhì)隨時(shí)間的變化

表4 梨子酒香氣物質(zhì)分類匯總表

從安琪酵母菌發(fā)酵的蘋果酒中檢測出的主要香氣物質(zhì)有癸酸乙酯、苯乙醇、辛酸乙酯、2,4,5-三甲基-1,3-二氧戊環(huán)、3-甲基-1-丁醇、乙縮醛、十二酸乙酯等，這些香氣物質(zhì)賦予蘋果酒酒香、花香、果香等香氣特征。

2.2.2 發(fā)酵梨子酒的香氣物質(zhì) 由圖2，表6可知，分別接種香坊腸桿菌(試驗(yàn)組)和安琪酵母菌(對照組)發(fā)酵梨子酒檢測出的香氣物質(zhì)中，有24種相同香氣物質(zhì)，有12種從試驗(yàn)組檢測出而對照組未檢測出，有11種從對照組檢測出而試驗(yàn)組未檢測出。試驗(yàn)組總醇15.87%，總酯36.35%；對照組總醇23.29%，總酯51.26%。

從香坊腸桿菌發(fā)酵的梨子酒中檢測出的主要香氣物質(zhì)有庚醛、乙酸苯乙酯、3-甲基-1-丁醇、2,4,5-三甲基-1,3-二氧戊環(huán)、異丁酸、乙縮醛、癸酸乙酯、苯乙醇、2-甲基-2-乙基丙酸乙酯、3-甲基丁基乙酸酯等，這些香氣物質(zhì)賦予梨子酒酒香、花香、果香、甜香、青草氣等香氣特征。

圖1 蘋果酒發(fā)酵第28天香氣物質(zhì)圖譜

Figure 1 TIC diagram of aroma substance on the 28 day of apple wine fermentation

從安琪酵母菌發(fā)酵的梨子酒中檢測出的主要香氣物質(zhì)有癸酸乙酯、苯乙醇、辛酸乙酯、2,4,5-三甲基-1,3-二氧戊環(huán)、乙縮醛、十二酸乙酯、3-甲基-1-丁醇和己酸乙酯等，這些香氣物質(zhì)賦予梨子酒酒香、花香、果香等香氣特征。

3 結(jié)論

香坊腸桿菌和安琪酵母發(fā)酵果酒有其相同的香氣物質(zhì)，但在總體上香氣成分種類和含量都有很大的差異。二者既有相似的基本香氣構(gòu)成，又有其獨(dú)特的香氣特點(diǎn)。癸酸乙酯、辛酸乙酯、苯乙醇等賦予二者酒香、果香和花香，其中安琪酵母菌發(fā)酵產(chǎn)生的癸酸乙酯、辛酸乙酯百分含量更高，果酒酒香更明顯；而香坊腸桿菌發(fā)酵產(chǎn)生的乙酸苯乙酯和庚醛賦予果酒甜香和青草氣。

圖2 梨子酒發(fā)酵第28天的香氣物質(zhì)圖譜

Figure 2 TIC diagram of aroma substance on the 28 day of pear wine fermentation

表5香坊腸桿菌和安琪酵母菌發(fā)酵蘋果酒第28天的香氣物質(zhì)對比

Table 5 Comparison of aroma components between enterobacter aeruginosa and angel yeast fermented apple wine on the 28 Day %

組分香坊腸桿菌安琪酵母2,4,5-三甲基-1,3-二氧戊環(huán)10.882 69.078 7乙縮醛7.275 76.314 43-甲基-1-丁醇5.323 18.634 2醋酸異丁酯1.727 80.239 3正己醇0.583 20.996 43-甲基丁基乙酸酯3.195 91.678 82-甲基丁基乙酸酯0.875 80.338 61-(1-乙氧基乙氧基)-戊烷0.259 53.121 5己酸乙酯0.462 42.144 0壬醛0.877 50.273 2苯乙醇5.302 813.945 0十六酸乙酯1.707 50.626 6辛酸乙酯6.235 312.390 8癸醛1.553 90.676 2乙酸苯乙酯7.510 10.738 49-癸烯酸乙酯0.532 41.676 4癸酸乙酯10.381 324.897 72,4-二(1,1-二甲基乙基)苯酚1.287 20.238 6十二酸乙酯1.443 65.100 9鄰苯二甲酸二乙酯1.064 10.166 22,3-二甲基己烷0.652 8甲基戊醇0.131 2二氫-2-甲基-3(2H)-噻吩酮0.477 32-乙基己醇0.222 3DL-2-羥基己酸乙酯0.166 3庚酸乙酯0.556 0樟腦0.626 4薄荷醇0.246 73,4,5-三甲基-4-庚醇0.604 1琥珀酸二乙酯0.352 0萘1.528 7苯乙酸乙酯0.233 5壬酸乙酯0.214 8辛酸3-甲基丁酯0.135 6香葉基丙酮0.176 8正十五烷0.129 3十五烷酸-3-甲基丁酯0.134 1十四酸乙酯0.135 9乙酸正丙酯0.586 3庚醛15.454 12-甲基-2-乙基丙酸乙酯4.666 7異丁酸5.923 32-甲基丁酸1.416 1奧苷菊環(huán)1.893 01-丁醇0.480 0十七烷0.456 48-甲基十七烷0.642 5

表6香坊腸桿菌和安琪酵母菌發(fā)酵梨子酒第28天的香氣物質(zhì)對比

Table 6 Comparison of aroma components between enterobacter aeruginosa and angel yeast fermented pear wine on the 28 Day %

組分安琪酵母香坊腸桿菌2,4,5-三甲基-1,3-二氧戊環(huán)8.242 68.524 8乙縮醛5.095 35.893 93-甲基-1-丁醇4.140 98.790 9庚醛5.548 614.377 72-甲基-2-乙基丙酸乙酯0.753 03.641 7異丁酸1.172 26.681 1醋酸異丁酯0.284 92.478 73-甲基丁酸0.187 60.647 52-甲基丁酸0.185 22.119 43-甲基丁基乙酸酯1.196 73.631 92-甲基丁基乙酸酯0.298 21.246 1二氫-2-甲基-3(2H)-噻吩酮0.680 60.788 82-乙基己醇0.215 30.592 6壬醛0.531 21.415 4苯乙醇17.318 44.643 5奧苷菊環(huán)1.524 82.099 8辛酸乙酯14.064 82.008 4癸醛1.381 62.580 5乙酸苯乙酯1.139 610.312 4癸酸乙酯20.574 04.936 3十二酸乙酯4.726 90.864 5十四酸乙酯0.283 60.612 7十六酸乙酯1.903 52.956 2十八酸乙酯0.179 60.494 0正己醇0.306 01 -庚醇1.143 3己酸乙酯3.043 4芳樟醇0.170 8十三碳醛0.234 6琥珀酸二乙酯0.806 0反-4-癸烯酸乙酯1.144 0辛酸3-甲基丁酯0.292 0香葉基丙酮0.317 33,5-二叔丁基苯酚0.348 29-十六碳烯酸乙酯0.565 11-丁醇0.944 6丙酸乙酯0.256 2乙酸正丙酯1.194 62,4-二(1,1-二甲基乙基)苯酚2.085 5鄰苯二甲酸二乙酯0.637 2十七烷0.257 0鄰苯二甲酸二異丁酯0.359 2十五酸乙酯0.303 02-癸烯-1-醇0.411 2二十烷0.316 3油酸乙酯0.407 33-甲基-1-戊醇0.488 9

由于不同香氣物質(zhì)閾值不同，各成分之間可能相互影響，香氣成分對果酒的影響與其含量并不呈正相關(guān)，所以不能單依據(jù)香氣成分含量評價(jià)香坊腸桿菌發(fā)酵果酒與安琪酵母發(fā)酵果酒的優(yōu)劣。要解決此問題可結(jié)合感官品評評價(jià)香坊腸桿菌發(fā)酵果酒。