趙勝娟 向進(jìn)樂 陳樹興費(fèi) 鵬 徐云鳳 李建科

(1. 陜西師范大學(xué)食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西 西安 710119；2. 河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽 471023)

膽固醇代謝有著嚴(yán)格的調(diào)控機(jī)制，在正常情況下，細(xì)胞內(nèi)的膽固醇代謝保持著動(dòng)態(tài)平衡，該平衡一旦打破會(huì)導(dǎo)致機(jī)體病變，因此維持機(jī)體細(xì)胞內(nèi)膽固醇的動(dòng)態(tài)平衡至關(guān)重要[1-2]。當(dāng)機(jī)體內(nèi)皮細(xì)胞受到外界刺激發(fā)生損傷時(shí)，巨噬細(xì)胞對(duì)膽固醇的攝入不受細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量負(fù)反饋機(jī)制的調(diào)節(jié)，進(jìn)而會(huì)打破巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇的平衡，在細(xì)胞內(nèi)形成大量脂滴，直至巨噬細(xì)胞發(fā)生泡沫化，導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)的發(fā)生，嚴(yán)重地危害人們的健康[3-4]。

石榴皮多酚(pomegranate peel polyphenols，PPPs)是石榴中重要的活性成分，具有抗氧化、抗癌、抗菌、降血脂等多種生物學(xué)功能[5]。研究[6-7]表明PPPs可以降低巨噬細(xì)胞膽固醇和氧化脂質(zhì)的積累，以抑制泡沫細(xì)胞的形成，從而減少AS及心血管疾病的發(fā)生，然而，石榴多酚抑制泡沫細(xì)胞形成的機(jī)制尚不完全清楚。促進(jìn)巨噬細(xì)胞膽固醇流出對(duì)減少細(xì)胞內(nèi)脂滴形成、防止巨噬細(xì)胞泡沫化和AS發(fā)生具有重要意義，已經(jīng)成為了研究減緩或防止AS發(fā)生的一個(gè)新靶點(diǎn)[8]。現(xiàn)有研究[9-11]表明，清道夫受體 B1(Scavenger receptor B1，SR-B1)、酰基輔酶A：膽固醇?；D(zhuǎn)移酶(acyl-coenzyme A1: cholesterol acyltransferase，ACAT1)和膽固醇酯水解酶(cholesteryl ester hydrolase，nCEH)與機(jī)體膽固醇的流出密切相關(guān)。SR-B1是重要的抗AS受體，參與膽固醇酯的逆轉(zhuǎn)運(yùn)，能夠有效地促進(jìn)膽固醇的流出[12]。ACAT1和nCEH是調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)膽固醇平衡代謝的關(guān)鍵蛋白[10]，能夠維持細(xì)胞中游離膽固醇(free cholesterol，F(xiàn)C)的濃度，促進(jìn)膽固醇的流出。因此，分析PPPs對(duì)SR-B1、ACAT1和nCEH蛋白表達(dá)調(diào)控作用對(duì)解釋該物質(zhì)促進(jìn)膽固醇流出的作用機(jī)制至關(guān)重要。

本試驗(yàn)擬以PPPs為研究對(duì)象，構(gòu)建Raw264.7巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞模型，探索PPPs對(duì)SR-B1及膽固醇平衡代謝關(guān)鍵蛋白酶(SR-B1、ACAT1和nCEH)表達(dá)的影響，分析在PPPs作用下ACAT1和nCEH酶活性的變化，為揭示PPPs促進(jìn)膽固醇流出及抑制泡沫細(xì)胞形成的機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

PPPs：紫外檢測(cè)多酚含量為60%，主要成分為鞣花酸、沒食子酸和安石榴苷，在濃度為0～50 μg/mL時(shí)對(duì)巨噬細(xì)胞無毒性[13]，陜西天地源生物科技有限公司；

Raw264.7小鼠巨噬細(xì)胞：陜西師范大學(xué)食品營(yíng)養(yǎng)與安全實(shí)驗(yàn)室保存；

膽固醇測(cè)定試劑盒：北京普利來基因技術(shù)有限公司；

ox-LDL、高密度脂蛋白(High density lipoprotein，HDL)：廣州奕源生物公司；

DMEM無酚紅基礎(chǔ)培養(yǎng)基：美國(guó)Hyclone公司；

胎牛血清：Gibco 10099-141，美國(guó)Gibco| Life Technologies公司；

ACAT1(BS8471)：美國(guó)Bioworld Technology公司；

nCEH(ab111544)抗體、SR-B1抗體(ab52629)：英國(guó)Abcam公司；

ACAT1、nCEH的ELISA試劑盒：上海酶聯(lián)生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器

普通倒置顯微鏡：OLYMPUS CKX41型，日本OLYMPUS公司；

全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀：Multiskan GO型，美國(guó)熱電公司；

生物柜：ESCO AC2-4S1型，新加坡 ESCO有限公司；

脫色搖床：WD-9405A型，北京六一儀器廠；

暗匣：AX-Ⅱ型，廣東粵華醫(yī)療器械廠有限公司；

電泳儀：DYY-6C型，北京六一儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 Raw264.7巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞模型的建立

收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的小鼠巨噬細(xì)胞Raw264.7，調(diào)整到適宜濃度，接種于12孔板，正常培養(yǎng)24 h后，更換無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12 h，使細(xì)胞同步化，然后分為正常對(duì)照組，泡沫細(xì)胞模型組(Ox-LDL)組，正常對(duì)照組更換新鮮培養(yǎng)基，泡沫細(xì)胞組加入含60 μg/mL Ox-LDL的培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)24 h，棄培養(yǎng)基用PBS清洗2次，然后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行油紅O染色，測(cè)定其游離膽固醇和總膽固醇[14]。

1.3.2 石榴皮多酚對(duì)HDL介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞膽固醇流出的影響 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的小鼠巨噬細(xì)胞Raw264.7，調(diào)整到適宜濃度，接種于96孔板，正常培養(yǎng)24 h后，細(xì)胞用PBS清洗2次，更換無血清培養(yǎng)基，并分成4組(對(duì)照和藥物處理組)，具體分組情況見表1，藥物組加入各濃度PPPs對(duì)細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，1 h后加入ox-LDL(終濃度為60 μg/mL)，再繼續(xù)培養(yǎng)24 h，之后更換含HDL(50 μg/mL)的無血清無酚紅培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，24 h后收集細(xì)胞液，4 ℃、10 000 r/min離心5 min，然后用膽固醇測(cè)定試劑盒測(cè)定上清膽固醇含量。

表1 細(xì)胞處理分組

1.3.3 Western blotting法檢測(cè)SR-B1、ACAT1和nCEH的蛋白表達(dá) 不同濃度PPPs預(yù)處理Raw264.7細(xì)胞1 h后，加入Ox-LDL共同作用泡沫細(xì)胞24 h后，收集細(xì)胞，確定蛋白濃度，然后將相同量的各蛋白樣品加入準(zhǔn)備好的各電泳孔中進(jìn)行10% SDS-PAGE電泳，然后將膠片轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，用5%脫脂乳進(jìn)行封閉，再用濾紙吸干封閉液，加入稀釋好的一抗(ACAT1抗體，nCEH抗體，SR-B1抗體)孵育過夜，然后與二抗孵育，結(jié)束后進(jìn)行ECL顯色，并用Quantity-one軟件處理[15]。

1.3.4 細(xì)胞ACAT1和nCEH酶活性的檢測(cè) 不同濃度PPPs預(yù)處理Raw264.7細(xì)胞1 h后，加入Ox-LDL共同作用泡沫細(xì)胞24 h后，收集細(xì)胞，然后采用 ELISA試劑盒檢測(cè)ACAT1和nCEH的酶活力。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所得數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用 SPSS13.0軟件分析，差異顯著性檢驗(yàn)采用單因素方差分析，并用 Duncan 法進(jìn)行多重比較，P<0.05 為差異顯著，P<0.01差異極顯著，表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 Raw264.7巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞模型的建立

由表2和圖1可知，總膽固醇、游離膽固醇和膽固醇酯含量均明顯增加，總膽固醇增加了近2倍，細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯占總膽固醇的比例(CE/TC)>50%，表示泡沫細(xì)胞模型建立成功[16]。油紅O染色結(jié)果顯示，巨噬細(xì)胞內(nèi)無明顯紅色脂滴，而泡沫細(xì)胞內(nèi)有大量紅色脂滴存在，進(jìn)一步顯示泡沫細(xì)胞模型構(gòu)建成功。

2.2 石榴皮多酚對(duì)HDL介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞膽固醇流出的影響

圖2顯示，隨著PPPs濃度的增加，HDL介導(dǎo)的總膽固醇流出量也呈遞增趨勢(shì)，呈現(xiàn)一定的劑量效應(yīng)關(guān)系，但5，25 μg/mL 劑量均未能達(dá)到差異顯著性，50 μg/mL劑量則極顯著增加了膽固醇流出量，增加量達(dá)50%以上。

2.3 石榴皮多酚對(duì)Raw264.7細(xì)胞SR-B1蛋白表達(dá)的影響

由圖3可知，Raw264.7細(xì)胞SR-B1蛋白的表達(dá)受到了PPPs影響，且當(dāng)PPPs濃度為25 μg/mL時(shí)調(diào)控作用最顯著。利用Quantity-one軟件對(duì)SDS-PAGE圖譜進(jìn)行量化，如圖4所示，當(dāng)PPPs的劑量為25，50 μg/mL時(shí)，SR-B1蛋白的表達(dá)量顯著上調(diào)(P<0.01)，且以25 μg/mL劑量對(duì)SR-B1的上調(diào)作用最強(qiáng)。但PPPs對(duì)SR-B1蛋白表達(dá)的影響并未呈現(xiàn)良好的劑量關(guān)系。

表2 細(xì)胞泡沫化程度

圖1 巨噬細(xì)胞和泡沫細(xì)胞油紅O染色圖Figure 1 Macrophage and foam cell oil red O

**表示與對(duì)照相比差異極顯著(P<0.01)

圖3 不同濃度PPPs作用下SR-B1受體表達(dá)圖譜

Figure 3 The expression pattern of SR-B1 receptor after treatments with different concentrations of PPPs

**表示與對(duì)照相比差異極顯著(P<0.01)

Figure 4 Effect of PPPS on the protein expression of SR-B1 in Raw264.7 Macrophages (n=3)

2.4 石榴皮多酚對(duì)Raw264.7細(xì)胞ACAT1和nCEH蛋白表達(dá)的影響

由圖5可知，PPPs處理組對(duì)Raw264.7細(xì)胞ACAT1和nCEH蛋白的表達(dá)無顯著影響。利用Quantity-one軟件量化后的結(jié)果(圖6)，表明PPPs對(duì)Raw264.7細(xì)胞ACAT1和nCEH蛋白表達(dá)的作用不顯著(P>0.05)。

2.5 石榴皮多酚對(duì)Raw264.7細(xì)胞ACAT1和nCEH活性的影響

PPPs對(duì)Raw264.7細(xì)胞ACAT1和nCEH活性的影響見表3。在不同劑量PPPs受試物處理下，PPPs各劑量組顯著降低了ACAT1活性(P<0.01)，而顯著升高了nCEH活性(P<0.01)。說明PPPs可以減少膽固醇酯化，減少泡沫細(xì)胞內(nèi)的脂滴。同時(shí)PPPs可以促進(jìn)膽固醇酯水解，使膽固醇變?yōu)橛坞x膽固醇，對(duì)促進(jìn)膽固醇的流出具有積極意義。

圖5 不同濃度PPPs作用下ACAT1和nCEH

Figure 5 The proteins expression pattern of ACAT1 and nCEH after treatments with different concentrations of PPPs

圖6 石榴皮多酚對(duì)Raw264.7細(xì)胞ACAT1和nCEH

Figure 6 Effect of PPPs on ACAT1 and nCEH protein expression in Raw264.7 macrophages (n=3)

表3 石榴皮多酚對(duì)Raw264.7細(xì)胞ACAT1和nCEH活性的影響?

? **表示與對(duì)照相比差異極顯著(P<0.01)。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)研究了PPPs對(duì)HDL介導(dǎo)的膽固醇流出及相關(guān)蛋白SR-B1的調(diào)控作用，并揭示了PPPs對(duì)膽固醇在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)化的2個(gè)關(guān)鍵酶ACAT1和nCEH的影響。結(jié)果表明PPPs可以通過上調(diào)SR-B1蛋白促進(jìn)膽固醇流出，同時(shí)，PPPs雖然未能顯著影響nCEH和ACAT1蛋白的表達(dá)，但是降低了ACAT1的活性，提高了nCEH的活性，有助于減少巨噬細(xì)胞內(nèi)脂滴的蓄積，催化泡沫細(xì)胞脂滴中的膽固醇酯水解成游離膽固醇，并通過細(xì)胞膜上膽固醇運(yùn)載體ABCA1、SR-B1將游離膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)到外源性受體。本研究的結(jié)果完善了PPPs促進(jìn)Raw264.7巨噬細(xì)胞膽固醇流出的機(jī)理，解釋了泡沫細(xì)胞被PPPs抑制的機(jī)制，為利用PPPs防治動(dòng)脈粥樣硬化等心血管疾病提供了理論依據(jù)。

此外，本研究并未揭示PPPs對(duì)膽固醇流出關(guān)鍵酶ACAT1和nCEH酶活作用的機(jī)理，需要進(jìn)一步深入探索PPPs對(duì)ACAT1、nCEH酶活影響的途徑，從而更加全面地解釋PPPs促進(jìn)膽固醇流出的機(jī)制。