陳弟詩(shī)，陳斌，章健，邱明雙，鄧飛，王澤洲

（1.四川省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，四川 成都 610041；2.成都微瑞生物科技有限公司，四川 郫都 611731）

禽流感病毒（AIV）為正粘病毒科甲型流感病毒屬，單股負(fù)鏈RNA病毒。依據(jù)其外膜血凝素（H）和神經(jīng)氨酸酶（N）蛋白可分為H亞型和N亞型，目前已發(fā)現(xiàn)18個(gè)HA和11個(gè)NA亞型［1］。已報(bào)道能感染人類的禽流感病毒有H5［2］、H7［3］、H9［4］等亞型。其中H5、H7為高致病性亞型，潛伏期短，大多無(wú)臨床癥狀而突然死亡，發(fā)病率和致死率極高［5-6］；H9為中低致病性亞型，幾乎所有的養(yǎng)禽場(chǎng)均存在［7］，各型禽流感還可與其他病原混合感染，導(dǎo)致禽病復(fù)雜化。禽流感不僅危害養(yǎng)禽業(yè)，也嚴(yán)重威脅人類健康，影響國(guó)際貿(mào)易。因此，研發(fā)、篩選和使用快速準(zhǔn)確的臨床檢測(cè)方法對(duì)于禽流感的防控具有重要意義［8］。目前，禽流感診斷方法較多，國(guó)標(biāo)方法有雞胚培養(yǎng)分離法、血凝和血凝抑制試驗(yàn)、瓊脂凝膠免疫擴(kuò)散試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、RT-PCR、熒光定量RT-PCR，以及農(nóng)業(yè)農(nóng)村部推薦的免疫酶滲濾（Dot-ELISA）法和膠體金免疫層析試紙條法［9］，這些方法各有優(yōu)缺點(diǎn)和適用范圍。本試驗(yàn)主要選用了目前已商品化的禽流感病原高敏快速熒光免疫法、膠體金免疫層析紙條法和實(shí)時(shí)熒光RT-PCR法進(jìn)行研究，對(duì)比這三種方法在臨床快速診斷中的實(shí)用性，為禽流感病毒檢測(cè)提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 禽流感病毒 H5、H7和H9亞型血凝抑制試驗(yàn)抗原，均購(gòu)自哈爾濱獸醫(yī)研究所。

1.1.2 試劑 禽流感病毒高敏快速熒光免疫檢測(cè)試劑盒由成都微瑞生物科技有限公司提供；禽流感病毒熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒（通用型）購(gòu)自哈爾濱國(guó)生生物科技股份有限公司；國(guó)產(chǎn)禽流感病毒抗原檢測(cè)卡購(gòu)自國(guó)內(nèi)某生物股份有限公司，進(jìn)口禽流感病毒抗原檢測(cè)卡購(gòu)自韓國(guó)某公司。

1.1.3 主要儀器 WellrayRWR-1608熒光儀，由成都微瑞生物科技有限公司生產(chǎn)；熒光定量PCR儀CFX96，由美國(guó)BIO-RAD公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 檢測(cè)樣品的制備 將禽流感病毒H5、H7和H9三種亞型血凝抑制試驗(yàn)抗原分別用0.1 M PBS 按 2-2×10-1（1∶40）、2-3×10-1（1∶80）、2-4×10-1（1∶160）……2-12×10-1（1∶40 960）稀釋成12個(gè)梯度系列，備用。

1.2.2 高敏快速熒光免疫法 使用禽流感病毒高敏快速熒光免疫檢測(cè)試劑盒分別對(duì)禽流感病毒H5、H7和H9三種亞型抗原的12個(gè)稀釋度樣品進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)稀釋度做一個(gè)重復(fù)。用微量加樣槍吸取80 μL檢測(cè)樣品，按稀釋梯度有序加入試劑卡加樣孔，靜置15 min后，將檢測(cè)卡依次放入WellrayRWR-1608熒光儀讀數(shù)，通過(guò)微瑞生物云平臺(tái)手機(jī)APP直接得出判定結(jié)果：T/C值大于0.6，被檢樣品判為陽(yáng)性。

1.2.3 免疫層析法（膠體金試紙條） 使用國(guó)產(chǎn)和進(jìn)口兩種禽流感病毒檢測(cè)卡分別對(duì)禽流感病毒H5、H7和H9三種亞型抗原的12個(gè)稀釋度樣品進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)稀釋度做一個(gè)重復(fù)，并設(shè)置陰性對(duì)照。用微量加樣槍吸取80 μL檢測(cè)樣品，按稀釋梯度有序加入檢測(cè)卡加樣孔中，加樣完成后靜置，5～30min內(nèi)觀察結(jié)果。肉眼觀察試紙條上的質(zhì)控線（C線）和檢測(cè)線（T線），當(dāng)C線和T線同時(shí)出現(xiàn)條帶時(shí)，被檢樣品判為陽(yáng)性。

1.2.4 熒光定量RT-PCR法 使用禽流感病毒熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒（通用型）分別對(duì)禽流感病毒H5、H7和H9三種亞型抗原的12個(gè)稀釋度樣品進(jìn)行檢測(cè)。按試劑盒說(shuō)明書操作，采用柱式RNA提取法分別對(duì)三種亞型12個(gè)稀釋度樣品的RNA進(jìn)行提取。反應(yīng)擴(kuò)增條件為：第一階段，反轉(zhuǎn)錄50℃ 30 min；第二階段，預(yù)變性95℃ 3 min；第三階段95℃ 15 s，60℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)，熒光信號(hào)采集設(shè)置在第三階段退火時(shí)進(jìn)行。結(jié)果判定：Ct值小于35時(shí)，被檢樣品判為核酸陽(yáng)性。

2 結(jié)果

2.1 高敏快速熒光免疫法 禽流感病毒H5亞型抗原樣品：2-2×10-1至2-8×10-1稀釋度為陽(yáng)性，表明禽流感病毒高敏快速熒光免疫檢測(cè)試劑盒最高可檢出稀釋度為2-8×10-1（1∶2 560）的H5亞型樣品；禽流感病毒H7亞型抗原樣品：2-2×10-1至2-7×10-1稀釋度為陽(yáng)性，表明該試劑盒最高可檢出稀釋度為2-7×10-1（1∶1 280）的H7亞型樣品；禽流感病毒 H9 亞型抗原樣品：2-2×10-1至2-6×10-1稀釋度為陽(yáng)性，表明該試劑盒最高可檢出稀釋度為2-6×10-1（1∶640）的H9亞型樣品。

2.2 膠體金免疫層析法

2.2.1 某國(guó)產(chǎn)禽流感病毒檢測(cè)卡 陰性對(duì)照可肉眼觀察到控制線（C線）出現(xiàn)明顯條帶，檢測(cè)線（T線）也呈現(xiàn)出很弱的條帶，故無(wú)法準(zhǔn)確判定結(jié)果（圖1）。

圖1 某國(guó)產(chǎn)禽流感膠體金免疫層析檢測(cè)卡

2.2.2 某進(jìn)口禽流感病毒抗原檢測(cè)卡 陰性對(duì)照可肉眼觀察到只有控制線（C線）出現(xiàn)明顯條帶。禽流感病毒H5亞型抗原樣品在2-2×10-1至2-8×10-1（1∶2 560）稀釋度，檢測(cè)線（T線）出現(xiàn)明顯條帶（+++），到2-11×10-1（1∶20 480）稀釋度，條帶表現(xiàn)弱陽(yáng)性（+）（圖2）；禽流感病毒H7亞型抗原樣品在 2-2×10-1至 2-4×10-1（1∶160）稀釋度，檢測(cè)線（T線）出現(xiàn)明顯條帶，到2-5×10-1（1∶320）稀釋度，條帶表現(xiàn)弱陽(yáng)性（圖3）；禽流感病毒H9亞型抗原樣品在 2-2×10-1至 2-7×10-1（1∶1 280）稀釋度，檢測(cè)線（T線）出現(xiàn)明顯條帶，到2-10×10-1（1∶10240）稀釋度，條帶表現(xiàn)弱陽(yáng)性（圖4）。3種亞型樣品的條帶顏色均是隨稀釋度的升高而減弱。

2.3 熒光定量RT-PCR法 本次試驗(yàn)方案設(shè)定的禽流感病毒H5、H7和H9三種亞型最高稀釋度2-12×10-1（1∶40 960）樣品的CT值均小于試劑盒中陽(yáng)性判定值35，且有典型的曲線，判定為陽(yáng)性（圖5、圖6）。表明禽流感病毒熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒（通用型）對(duì)H5、H7和H9三種亞型病原的檢出靈敏度均高于稀釋度2-12×10-1（1∶40960）。

圖2 進(jìn)口通用抗原檢測(cè)卡對(duì)H5亞型梯度稀釋的檢測(cè)結(jié)果

圖3 進(jìn)口通用抗原檢測(cè)卡對(duì)H7亞型梯度稀釋的檢測(cè)結(jié)果

2.4 三種檢測(cè)方法的結(jié)果比較 將三種方法的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較，可以發(fā)現(xiàn)：（1）禽流感病毒熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒（通用型）的檢測(cè)靈敏度是三種方法中最高的；（2）禽流感病毒高敏快速熒光免疫檢測(cè)試劑盒對(duì)H5亞型禽流感抗原的靈敏度為2-8×10-1（1∶2560），比對(duì)H7亞型高2倍，比對(duì)H9亞型高4倍；（3）某進(jìn)口禽流感病毒抗原檢測(cè)卡（膠體金免疫層析法）對(duì)H5和H9亞型的靈敏度達(dá)2-11×10-1（1∶20 480）和2-10×10-1（1∶10240），而對(duì)H7亞型的靈敏度僅為2-5×10-1（1∶320），對(duì)H5的靈敏度是H7的64倍，對(duì)H9的靈敏度是H7的32倍（表1）。

圖4 進(jìn)口通用抗原檢測(cè)卡對(duì)H9亞型梯度稀釋的檢測(cè)結(jié)果

圖5 H5亞型抗原梯度稀釋熒光RT-PCR試劑盒檢測(cè)結(jié)果

圖6 H7亞型抗原梯度稀釋熒光RT-PCR試劑盒檢測(cè)結(jié)果

表1 三種方法檢測(cè)已知禽流感陽(yáng)性抗原的結(jié)果比較

3 討論

3.1 本試驗(yàn)中禽流感高敏快速熒光免疫法對(duì)禽流感三種亞型抗原的靈敏度較一致，能檢出亞型的最低稀釋倍數(shù)達(dá)2-6×10-1（1∶640），且能準(zhǔn)確讀數(shù)，可見(jiàn)該方法能作為實(shí)驗(yàn)室確診病原的有效方法。高敏快速熒光免疫法是近幾年發(fā)展成熟的一種高敏感性和高特異性的新檢測(cè)方法，既具有膠體金免疫層析法簡(jiǎn)單、方便、快捷等優(yōu)點(diǎn)，又具有PCR法的準(zhǔn)確、特異、敏感等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)以云平臺(tái)為基礎(chǔ)，形成了禽流感“現(xiàn)場(chǎng)移動(dòng)檢測(cè)+即時(shí)診斷+遠(yuǎn)程數(shù)據(jù)分析”的新檢測(cè)模式［10］，該方法適用于現(xiàn)場(chǎng)即時(shí)檢測(cè)（POCT），可在基層獸醫(yī)部門、養(yǎng)殖場(chǎng)等推廣應(yīng)用［11］。

3.2 本試驗(yàn)同時(shí)選用了國(guó)產(chǎn)和進(jìn)口的膠體金免疫層析試紙條進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)該類市售產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊，特別是國(guó)產(chǎn)產(chǎn)品存在假陽(yáng)性、準(zhǔn)確性較差、誤診率高的缺點(diǎn)；某進(jìn)口試紙條對(duì)H5、H9亞型禽流感敏感性高，但對(duì)H7亞型靈敏度較差，臨床上容易造成H7亞型的漏檢。而影響該類產(chǎn)品敏感度的因素很多，主要包括捕獲抗體、結(jié)合抗體的特異性，包被量、墊和膜材料選擇、膠體金顆粒大小濃度，緩沖體系的選擇使用等。因此，在選擇和使用膠體金免疫層析試紙條時(shí)進(jìn)行比對(duì)驗(yàn)證是非常必要的。由于不同廠家產(chǎn)品的檢測(cè)體系不同，選用的緩沖液也不同，在實(shí)際檢測(cè)過(guò)程中需嚴(yán)格按照各廠家說(shuō)明書，使用原廠配送的緩沖液進(jìn)行檢測(cè)，以提高準(zhǔn)確性。

3.3 本試驗(yàn)設(shè)定的三種禽流感病毒亞型樣品最高稀釋度2-12×10-1（1∶40 960）均未達(dá)到實(shí)時(shí)熒光RT-PCR試劑盒的檢測(cè)下限。表明實(shí)時(shí)熒光RTPCR法具有靈敏度高、特異性好、準(zhǔn)確性高等特點(diǎn)，但該方法操作繁瑣、容易污染，且靈敏度和準(zhǔn)確性還取決于前期樣品RNA的提取，需要專門的儀器和專業(yè)技術(shù)人員，大批量檢測(cè)時(shí)還需要其他配套設(shè)備，費(fèi)力、費(fèi)時(shí)、費(fèi)錢，因此僅適合用于專業(yè)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。

4 結(jié)論

通過(guò)以上三種方法的比較，可知實(shí)時(shí)熒光RT-PCR法的靈敏度最高，從分子角度的準(zhǔn)確性也最高，但檢測(cè)所需時(shí)間最長(zhǎng)；膠體金免疫層析試紙條檢測(cè)雖然耗時(shí)少，操作極簡(jiǎn)，但漏檢和假陽(yáng)性的可能性高，且對(duì)禽流感三種亞型抗原的檢測(cè)下限相比其他兩種方法均無(wú)顯著優(yōu)勢(shì)；高敏快速熒光免疫法的檢測(cè)靈敏度比實(shí)時(shí)熒光RT-PCR低，但迅速簡(jiǎn)便，可達(dá)到快速診斷的目的。

高敏快速熒光免疫法和膠體金免疫層析試紙條法適合用于臨床大量樣品的初步篩選；高敏快速熒光免疫法還可進(jìn)一步用于基層獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室的初篩；實(shí)時(shí)熒光RT-PCR法則適合對(duì)禽流感可疑病例的確診。在流行病學(xué)調(diào)查中，可采用高敏快速熒光免疫法或膠體金免疫層析法進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，既減少檢測(cè)時(shí)間和工作強(qiáng)度，又提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。