張 飛，高慧玲，劉寶玲，薛金愛，張紅梅，李潤植

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太谷030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)分子農(nóng)業(yè)與生物能源研究所，山西太谷030801）

大豆（Glycine max L.Merr）是我國四大油料作物之一，也是世界主要糧油作物。大豆種子含有豐富的油脂和植物蛋白，大豆油除了人和動物直接消費之外，還是生物燃料和化學(xué)生產(chǎn)的主要可再生資源[1]。目前全球植物油產(chǎn)量的30%均來源于大豆油，并且還在逐年上漲[2]。因此，培育高油大豆品種和提高大豆油產(chǎn)量對大豆育種至關(guān)重要。

三酰甘油（triacylglycerol，TAG）是植物中主要的儲存脂質(zhì)。在種子中，TAG在細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）膜上合成并通過出芽方式儲存于油體內(nèi)[3]。TAG的合成通常被認為由Kennedy途徑的相關(guān)酶催化，這些酶依次將?；湉孽；?CoA轉(zhuǎn)移到甘油骨架的sn-1，sn-2和sn-3位置而形成TAG[4]。二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶（Diacylglycerol acyltransferase，DGAT）參與TAG合成的最后一步反應(yīng)，通過將?；鶑孽；?CoA轉(zhuǎn)移到二?；视停╯n-1，2-diacylglycerol，DAG）的sn-3位置而起作用，是TAG合成的限速酶[5]。多重證據(jù)表明，DGAT在種子發(fā)育過程中影響種子含油量、脂肪酸組成以及種子百粒質(zhì)量等[6-9]。目前，根據(jù)DGAT的結(jié)構(gòu)、亞細胞定位等信息，可將DGAT酶分為3種類型：DGAT1，DGAT2和DGAT3[10]。其中，DGAT1和DGAT2為膜結(jié)合蛋白酶，但彼此之間不具同源性[11-12]?，F(xiàn)已在擬南芥（Arabidopsis thaliana）、油菜（Brassica napus）和大豆等植物中分離出編碼有功能的DGAT1或DGAT2的基因，這2類DGAT對不同植物種子油合成積累貢獻大小有差異[9，13-15]。DGAT3又稱胞質(zhì) DGAT（Cyto DGAT），為可溶性酶蛋白，最初從花生（Arachis hypogaea）發(fā)育中的子葉細胞質(zhì)中分離獲得，且具有DGAT酶活性[16]。DGAT3基因與DGAT1和DGAT2基因家族的相似性不足10%。目前，在擬南芥、亞麻薺（Camelina sativa）和大豆等油料作物中也發(fā)現(xiàn)了DGAT3的同源序列，但還未有功能驗證[1，17]。已有研究顯示，大豆基因組存在多個拷貝的DGAT3序列[1]，但各成員特性以及是否具體參與種子油脂的合成與積累還未證明。

本研究采用生物信息學(xué)工具，從大豆全基因組數(shù)據(jù)庫中篩選、鑒定大豆DGAT3蛋白，比較分析大豆DGAT3蛋白與花生DGAT3蛋白的理化性質(zhì)、保守結(jié)構(gòu)域、高級結(jié)構(gòu)等特征，并檢測大豆DGAT3基因的時空表達譜，以期深入解析大豆種子油脂生物合成及調(diào)控機制，為大豆種子油脂改良及高油品種培育提供科學(xué)參考。

1 材料和方法

1.1 大豆種質(zhì)及大豆DGAT3蛋白的鑒定

試驗所用大豆種質(zhì)材料為大豆品種Jack，種植于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)作站網(wǎng)室，由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)分子農(nóng)業(yè)與生物能源研究所保存及管理。

以花生AhDGAT3基因為檢索序列，在Phytozome v12.1的大豆基因組（https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#!info?alias=Org_Gmax） 中進行Blast分析，鑒定獲得2個完整的大豆DGAT3基因，分別命名為 GmDGAT3-1（Glyma.13G118300.1）和 GmDGAT3-2（Glyma.17G041600.1）。

1.2 大豆GmDGAT3蛋白的基本結(jié)構(gòu)分析

利用在線預(yù)測網(wǎng)站（http://www.expasy.org），對大豆GmDGAT3同源蛋白家族的分子量、等電點、親水性、穩(wěn)定性等方面進行預(yù)測，分析大豆GmDGAT3的基本理化性質(zhì)。使用在線軟件（http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/）預(yù)測大豆 GmDGAT3基因編碼蛋白的亞細胞定位，利用在線軟件TMHMMServer v.2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）分析GmDGAT3蛋白的跨膜區(qū)，使用在線軟件（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）解析大豆GmDGAT3基因編碼蛋白的二級結(jié)構(gòu)，用NCBI保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站（Conserved Domain Database，CDD）對 GmDGAT3蛋白的保守功能域分析，使用SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/interactive）同源建模，分析大豆GmDGAT3基因編碼蛋白的三維結(jié)構(gòu)。

1.3 大豆GmDGAT3蛋白的多序列比對和系統(tǒng)發(fā)育分析

表1 不同植物DGAT3蛋白的基本信息

使用在線軟件PRALINE program（http://www.ibi.vu.nl/programs/pralinewww/）對大豆 GmDGAT3 和花生AhDGAT3進行氨基酸序列多重比對分析；運用MEGA 6.0，采用鄰位連接法對大豆GmDGAT3和源于其他物種DGAT3蛋白序列（表1）構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.4 大豆GmDGAT3的表達檢測

根據(jù)鑒定獲得2種大豆GmDGAT3 CDS序列GmDGAT3-1和GmDGAT3-2，利用Primer 5.0設(shè)計qTR-PCR引物，內(nèi)參基因Actin引物和目的基因定量引物如表2所示。

表2 熒光定量PCR引物

本試驗使用BBI Life Science公司的Total RNA Extractor試劑盒提取大豆根、莖、葉、花、種子的總RNA，將所得到的RNA樣品保存于-80℃?zhèn)溆?。使用Genstar公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒cDNA Synthesis Kit合成cDNA模板。用Genstar公司2×增強型染料實時熒光定量PCR預(yù)混液進行qRT-PCR，反應(yīng)體系包括：1 μL DNA模板，正向和反向引物（定量引物列于表 1）各1μL（10nmol/L），21μLRNase-freeH2O，25 μL 2×RealStar Green Power Mixture 混合，1 μL ROXReferenceDye（50×）。反應(yīng)程序為：95℃10min；95℃ 15 s，53 ℃ 1 min，72 ℃ 30 s，40 個循環(huán)。每個樣品至少做3次生物學(xué)重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 GmDGAT3蛋白的理化性質(zhì)分析

為了進一步確定大豆GmDGAT3蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)，對預(yù)測編碼的氨基酸組成及理化性質(zhì)進行了分析（表3）。由表3可知，GmDGAT3-1和GmDGAT3-2蛋白質(zhì)所含氨基酸的數(shù)目分別為327，338個氨基酸，相對分子量分別為34.73，35.88 ku，其等電點也均為堿性。預(yù)測蛋白的不穩(wěn)定指數(shù)分別為40.63和38.95，為不穩(wěn)定蛋白。脂肪酸指數(shù)和親水性指數(shù)分析表明，GmDGAT3為水溶性蛋白，定位于細胞質(zhì)中。大豆GmDGAT3蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)與花生AhDGAT3相似性高。CUI等[18]從硅藻中分離的PtDGAT3基因編碼的蛋白長504個氨基酸，相對分子量為64.5 ku，可以明顯看出，高等植物的DGAT3蛋白的大小和長度要比低等植物短的多。大豆GmDGAT3基因編碼蛋白的亞細胞定位預(yù)測結(jié)果顯示，2個GmDGAT3蛋白最有可能定位在細胞質(zhì)中。跨膜區(qū)分析結(jié)果顯示，GmDGAT3編碼的蛋白均無跨膜結(jié)構(gòu)，表明大豆GmDGAT3蛋白與花生AhDGAT3蛋白一樣，均為可溶性蛋白。

表3 大豆DGAT3和花生DGAT3蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析

2.2 GmDGAT3蛋白的高級結(jié)構(gòu)分析

二級結(jié)構(gòu)預(yù)測發(fā)現(xiàn)（圖1），GmDGAT3s是由α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲和直鏈延伸組成。GmDGAT3-1中比例最高的為無規(guī)則卷曲和α-螺旋，比例均為37.00%；其次為直鏈延伸，占18.65%，β-轉(zhuǎn)角占7.34%。GmDGAT3-2中比例最高的為無規(guī)則卷曲，占38.17%；其次是α-螺旋，占33.14%；直鏈延伸占21.89%；β-轉(zhuǎn)角含量最少，占6.80%。各二級結(jié)構(gòu)元件所占比例有較小差異，但均與花生AhDGAT3有很大程度上的相似性。

通過保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫（Conserved Domain Database，CDD）對GmDGAT3蛋白的保守功能域分析，結(jié)果顯示，GmDGAT3-1和GmDGAT3-2蛋白保守結(jié)構(gòu)域都具有TRX-like Fds[19]及含有類似TRX-like Fd的結(jié)構(gòu)域，屬于TRX-like Fd family超基因家族。通過SWISS對GmDGAT3蛋白進行三維結(jié)構(gòu)分析（圖2），以ID1m2b.1一種鐵氧還蛋白為模板，對GmDGAT3-1，GmDGAT3-2和花生AhDGAT3進行建模分析，其與模板的相似性分別為25.00%，25.97%和19.23%，均由2個亞基組成，且均勻?qū)ΨQ。

2.3 GmDGAT3蛋白氨基酸序列比對及系統(tǒng)進化樹分析

使用PRALINE program在線軟件對比大豆GmDGAT3-1，GmDGAT3-2和花生AhDGAT3的氨基酸序列，結(jié)果顯示，GmDGAT3-1，GmDGAT3-2和花生AhDGAT3的序列相似性分別為45%和43%，GmDGAT3-1和GmDGAT3-2之間序列相似性為82%。對比其他DGAT蛋白相關(guān)保守序列可知（圖3），Ⅰ，Ⅳ和Ⅵ區(qū)域為潛在的DGAT保守序列，Ⅱ為一個假定的硫?；；D(zhuǎn)移酶中間標記保守區(qū)，Ⅲ為Tyr激酶磷酸化保守位點，Ⅴ為脂肪酸結(jié)合蛋白保守區(qū)[20]。大豆GmDGAT3-1和GmDGAT3-2所存在的多個功能位點可能預(yù)示著其在油脂代謝合成中具有DGAT酶功能。

將大豆GmDGAT3的蛋白序列與已知的DGAT3的蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹（圖4），結(jié)果顯示，大豆2個GmDGAT3蛋白均與豆科植物有較大的相似性，這些豆科植物包括花生、紅車軸草、綠豆、刺毛黧豆、木豆、大豆；大豆GmDGAT3與豆科植物刺毛黧豆和木豆親緣關(guān)系最近。進化關(guān)系分析顯示，大豆GmDGAT3與花生DGAT3蛋白的相似性較高，推測大豆GmDGAT3可能也具備DGAT酶活性。

2.4 大豆DGAT3在不同組織中的表達分析

為探究大豆DGAT3在不同組織中的表達情況，通過qRT-PCR檢測大豆GmDGAT3-1和GmDGAT3-2在根、莖、葉、花、莢、種子等組織中的表達。以大豆基因Actin為內(nèi)參，計算各個組織中的表達情況。從圖5可以看出，GmDGAT3-1和GmDGAT3-2基因在大豆各個組織中均有表達，但表達量有明顯差異；GmDGAT3-2在各個組織中的表達量均高于GmDGAT3-1，且GmDGAT3-2在花中表達量最高，在豆莢和種子中也有較高表達。

3 結(jié)論與討論

近年來，植物油在生物柴油、食品保健、化工制藥等方面的應(yīng)用越來越廣泛，需求大于供給的市場極大地促進了油脂合成相關(guān)基因的研究。DGAT作為油脂合成的限速酶，已成為人們研究的重點，并在闡明植物油脂生物合成與代謝途徑，以及利用基因工程方法改良品質(zhì)方面獲得了較大發(fā)展。

本研究以花生DGAT3為模板，從大豆基因組鑒定獲得2個大豆DGAT3蛋白，分別命名為GmDGAT3-1和GmDGAT3-2。一系列理化性質(zhì)分析表明，GmDGAT3-1和GmDGAT3-2蛋白均定位于細胞質(zhì)中，為可溶性蛋白。然而，大豆GmDGAT1和GmDGAT2亞家族的蛋白均為疏水性蛋白，定位于細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上[21]。大豆GmDGAT3蛋白的理化性質(zhì)、二級結(jié)構(gòu)和三維結(jié)構(gòu)均與花生AhDGAT3有很大的相似性，且都由TRX-like Fd結(jié)構(gòu)域[19]的蛋白組成。多序列比較分析發(fā)現(xiàn)，大豆GmDGAT3蛋白存在DGAT典型的保守區(qū)以及?；D(zhuǎn)移酶結(jié)合位點。進化樹分析表明，大豆DGAT3蛋白與花生DGAT3蛋白同源性較高，因此，推測大豆DGAT3蛋白可能也具備DGAT酶活性。

本研究證實，大豆DGAT3在不同組織中均有表達，GmDGAT3-2在各個組織中的表達量均高于GmDGAT3-1，且在花中表達量最高，在豆莢和種子中也有較高表達。已有研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)高等植物的DGAT1在各器官中均有表達。AtDGAT1在發(fā)育中的種子、花瓣、花芽中表達量高，而在葉和莖中表達量低[22]。而大豆的DGAT1表達模式與擬南芥DGAT1相似[23]。DGAT3可能也存在與DGAT1相似的表達模式?；贕mDGAT3-2在花中表達量最高，推測GmDGAT3-2可能與TAG參與有性生殖相關(guān)。已有報道顯示，TAG占據(jù)了花粉塊質(zhì)量的30%～40%，但其在花粉中的具體作用還不清楚，可能是為花粉管生長所需膜脂的快速合成提供脂肪酸原料[24]?；ㄉ鶧GAT3在開花后8～24 d的種子中特異性表達，在25 d以后表達量低，在種子發(fā)育更晚的階段以及根和葉中均沒有表達[16]。推測GmDGAT3在豆莢和種子中的表達可能與種子形成過程中脂肪酸的積累有關(guān)，后期仍需進行相關(guān)的功能互補以及其他試驗驗證。自SAHA等[16]在花生子葉中發(fā)現(xiàn)DGAT3有DGAT功能后，DGAT3越來越引起人們注意。CUI等[18]研究發(fā)現(xiàn)，硅藻PtDGAT3基因可以彌補突變型H1246釀酒酵母不能合成TAG的缺陷，并優(yōu)先將C18不飽和脂肪酸轉(zhuǎn)化為TAG。RANI等[25]研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)油型酵母Rhodotorula glutinis的RgDGAT基因編碼的二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶也屬于DGAT3類酶，為可溶性蛋白酶，其過表達也能補償酵母突變菌株H1246中脂肪酸的缺失。陶芬芳[26]研究發(fā)現(xiàn)，油菜BnDGAT3轉(zhuǎn)入酵母和擬南芥后能改變脂肪酸成分組成。已有研究及本研究發(fā)現(xiàn)，一些物種的DGAT3可能具有較高的DGAT酶活性和可能的底物特異性，這些研究極大地豐富了植物油脂生物合成與代謝調(diào)控機理理論，也將有助于提高植物油產(chǎn)量以及改善品質(zhì)。

隨著分子生物學(xué)和全基因組測序技術(shù)的不斷發(fā)展，大豆相關(guān)功能基因陸續(xù)被挖掘[27-28]，本研究結(jié)果可為利用分子育種和基因工程等手段改良大豆品質(zhì)提供理論依據(jù)，也將為大豆育種的研究提供新思路。