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(1.貴州師范大學生命科學學院，貴州 貴陽 550000；2.貴州省林業(yè)廳，貴州 貴陽 550000；3.貴州師范大學喀斯特洞穴研究中心，貴州 貴陽 550000)

蝦青素(Astaxanthin)是一種非維生素A源類的胡蘿卜素，在常溫中呈現(xiàn)紫黑色結晶的粉末狀態(tài)，易被氧化且對陽光異常敏感，易溶于丙酮、二氯甲烷和氯仿等多數(shù)有機溶劑中[1]。蝦青素具有抗氧化的性質，其分子式中具有活潑的電子效應，極易和自由基發(fā)生反應而使自由基被清除，水產(chǎn)類生物體中含有蝦青素可以起到免疫、著色和保險的作用，對魚類的生長調節(jié)具有重要的作用，因而被譽為“超級維生素E”和“超級抗氧化劑”[2-5]。

自上世紀80年代開始，許多專家和學者對蝦青素的生物學功能進行大量研究，發(fā)現(xiàn)蝦青素擁有很多重要的生物學功能，安全性較好，因而越來越被人們所關注[6-7]。當前蝦青素的主要來源有：從雨生紅球藻中提取[9-10]、用法夫酵母生產(chǎn)[11-12]、從甲殼類水產(chǎn)廢棄物中提取[13-14]。陳西廣、何立堅[6、8]等研究了用乙酸乙酯浸提法提取甲殼類蝦青素的工藝流程，張芬[15]等用高效液相色譜法測定了小丑魚體內蝦青素的含量，宋慶洋[16]等研究了克氏原螯蝦蝦殼在三種不同干燥條件下蝦青素提取的效果，杜云建[17]等采用稀堿法從蝦殼中提取蝦青素，孫來娣[18]等研究了二氯甲烷一甲醇溶液提取南極磷蝦粉蝦青素的工藝條件。為了探究貴州草海小龍蝦(Procambarusclarkii)不同部位蝦青素含量，本研究中以貴州草海的小龍蝦為原料，采用單因素實驗確定最佳提取條件，運用分光光度法測定草海小龍蝦不同部位蝦青素的含量。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

小龍蝦(草海自然水域捕獲)、FA-1004型電子稱、HWS28型電熱恒溫水浴鍋、752型紫外可見分光光度計、SHZ-D(Ⅲ)型循環(huán)水真空泵、旋轉蒸發(fā)器RE-2000、乙酸乙酯(分析純AR)、乙醇(分析純AR)、石油醚(分析純AR)、異丙醇(分析純AR)、二氯甲烷(分析純AR)、燒杯、試管、漏斗、蝦青素標樣。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理 蝦殼處理：將小龍蝦蝦殼剝離去肉清洗干后，放入55 ℃的烘箱中烘干，稱量；將干蝦殼放入打粉機中打粉。

去蛋白質處理：取適量打好的干蝦粉，加入胃蛋白酶在溫度60 ℃、pH值為2.5的條件下水解1 h，水解后將濾渣進行抽濾，用蒸餾水水洗至中性，在陰涼通風處自然干燥。

蝦青素提取：稱量已定量經(jīng)過去蛋白處理的蝦殼粉，將樣品轉入燒杯中，加入適量的溶液，攪拌均勻，在一定溫度下浸提一段時間后，濾去溶液中的廢渣，得蝦青素提取溶液。

1.2.2 內臟、蝦肉中蝦青素的提取 內臟、蝦肉中蝦青素的提取方法同1.2.1相同。

1.3 繪制蝦青素標準曲線

配置標準溶液：用電子天平稱取1 mg的蝦青素標準樣品放入50 mL的容量瓶中，加入25 mL的乙酸乙酯溶液，配置得到0.04 mg·mL-1的蝦青素標準溶液。使用時用10 mL乙酸乙酯溶液分別稀釋成5、4、3、2和1 μg·mL-1等不同濃度梯度的蝦青素標準溶液。將稀釋后的溶液置于紫外分光光度計中(吸收波長為474 nm)測定吸光值。以稀釋濃度為橫坐標，蝦青素的吸光值為縱坐標，制作蝦青素的標準曲線圖。

1.4 蝦青素提取的單因素實驗

1.4.1 提取溶劑的選取 用天平稱取5份經(jīng)過去蛋白處理的蝦殼粉放入25 mL的試管中，分別將10 mL的乙醇、石油醚、乙酸乙酯、異丙醇和二氯甲烷加入到5個試管中，在常溫下提取3 h后，將溶液進行旋蒸干燥，分別再加入10 mL的石油醚溶液，將溶液置于紫外分光光度計中(吸收波長468 nm)測定吸光值。

1.4.2 料液比的選擇 用天平稱取5份經(jīng)過去蛋白處理的蝦殼粉放入25 mL的試管中，然后加入1.5 、3、4.5、6和7.5 mL的乙酸乙酯溶液，常溫下浸提3 h，旋蒸干燥后，將溶液置于紫外分光光度計中(吸收波長474 nm)測定吸光值。

1.4.3 提取溫度的選取 用天平稱取8份經(jīng)過去蛋白處理的蝦殼粉放入25 mL的試管中，分別加入10 mL乙酸乙酯溶液，將試管放入20、30、40、50、60、70、80和90 ℃的水浴鍋中進行加熱1 h后，將溶液置于紫外分光光度計中(吸收波長474 nm)測定吸光值。

1.4.4 提取時間的選取 用天平稱取5份經(jīng)過去蛋白處理的蝦殼粉放入25 mL的試管中，加入10 mL乙酸乙酯溶液，在溫度為60 ℃的水浴鍋中分別加熱1 h、2 h、3 h、4 h、5 h后，將溶液置于紫外分光光度計中(吸收波長474 nm)測定吸光值。

1.4.5 提取次數(shù)的選擇 用天平稱取3份經(jīng)過去蛋白處理的蝦殼粉放入25 mL的試管中，加入10 mL乙酸乙酯溶液，在60 ℃的水溫下提取1 h后，將溶液進行過濾，濾渣重新加入10 mL乙酸乙酯溶液重新加熱。此步驟重復4次，將4次所得溶液置于紫外分光光度計中(吸收波長474 nm)測定吸光值。

1.4.6 小龍蝦不同部位蝦青素含量的測定 用天平分別稱取處理后的蝦殼樣品2.0 g、內臟樣品5.0 g和蝦肉樣品25 g，按照單因素實驗中所得的最佳提取條件對小龍蝦3個部位的樣品進行蝦青素提取，并通過標準曲線計算不同部位蝦青素的含量。

2 結果與討論

2.1 蝦青素標準曲線圖

在乙酸乙酯最大的吸收波長474 nm處測得蝦青素各梯度標準溶液的吸光值(如圖1所示)，乙酸乙酯溶液中蝦青素濃度和吸光值之間的關系式為y=0.166 4 x+0.018 4，R2=0.999 4，線性關系良好。

圖1 蝦青素標準曲線圖

2.2 單因素提取實驗的結果

2.2.1 溶劑的提取效果 從圖2中可以看出，5種不同溶劑對于蝦青素的提取效果差異明顯，其中乙酸乙酯溶液的提取效果最佳，所以選擇乙酸乙酯溶液為最宜提取溶劑。

2.2.2 料液比的最佳提取結果 從圖3種可以看出，隨著乙酸乙酯溶液用量的增加，料液比由1∶1到1∶2時吸光度增加幅度較大，而料液比為1∶2之后隨著溶液的增加吸光值變化不明顯，所以最佳的料液比為1∶2。

圖2 不同溶劑的提取效果圖

圖3 不同料液比下的吸光值圖

2.2.3 提取溫度的最佳結果 從圖4中可以看出，隨著提取溫度的增加吸光值也呈現(xiàn)出增大的趨勢，當溫度在60 ℃時吸光值達到最大，60 ℃后吸光值呈現(xiàn)減小的趨勢，故最佳的提取溫度應為60 ℃。

2.2.4 提取時間的結果 由圖5可以看出，隨著提取時間的增加，吸光度值在2 h處達到最高，此后隨著時間增加吸光度值呈現(xiàn)下降趨勢。故選擇最佳的提取時間為2 h。

圖4 不同提取溫度下的吸光值變化圖

圖5 提取時間對提取效果的影響

2.2.5 提取次數(shù)的結果 3份蝦殼樣品經(jīng)過4次提取后，提取結果如表1所示。經(jīng)過前兩次乙酸乙酯溶液浸提后，多數(shù)蝦青素已被提取出來，以至于3、4次提取出的蝦青素很少，所以最佳提取次數(shù)為2次。

表1 提取次數(shù)對提取效果的影響

2.3 各部位蝦青素含量的測定結果

通過上述的單因素實驗得出的最佳提取方法來測定草海4個樣地小龍蝦蝦殼、蝦肉和內臟中的蝦青素含量，結果如表2所示，草海小龍蝦蝦青素在4個樣地蝦殼中含量最高，西海碼頭(45.28±0.12 μg·g-1)、江家灣(38.24±0.14 μg·g-1)、吳家?guī)r頭(46.18±0.23 μg·g-1)、嘍啰山(42.97±0.26 μg·g-1)，4個樣地蝦肉和內臟中也含有少量蝦青素，但是含量遠低于蝦殼中的含量，這也說明了小龍蝦蝦青素主要富集在蝦殼中。

表2 4樣地小龍蝦不同部位的蝦青素含量

3 結論與討論

目前，蝦青素提取工藝的研究已經(jīng)取得了很大的進展，但是對于小龍蝦野外種群蝦青素的研究國內外報道相對較少。宋慶洋[16]等對潛江市小龍蝦蝦青素研究結果表明潛江小龍蝦蝦殼中蝦青素含量達到148.2 μg·g-1。孫來娣[17]等從南極磷蝦蝦粉中提取蝦青素的實驗結果顯示，蝦粉中蝦青素含量為179.21 μg·g-1，比本研究中草海小龍蝦蝦青素含量高，這可能是與兩地間環(huán)境因素有關；何立堅[8]等對明蝦蝦殼中蝦青素的研究結果顯示，明蝦蝦殼中蝦青素含量為38.285 μg·g-1；徐煜[9]等從雨生紅球藻中提取蝦青素的實驗結果顯示，雨生紅球藻中蝦青素的實際含量測定值為2.896%；陳西廣[6]等對海蝦蝦殼中蝦青素進行提取，實驗結果表明海蝦蝦殼中蝦青素含量為45.5 μg·g-1，與本研究中草海小龍蝦蝦青素含量基本一致，說明除環(huán)境因素外，蝦類水產(chǎn)品蝦青素含量可能相差程度不大。

筆者對貴州草海自然水域的小龍蝦不同部位蝦青素含量、蝦青素提取條件進行了研究，單因素實驗結果顯示，蝦殼中蝦青素的最佳提取條件為：用乙酸乙酯為浸提溶液，料液比為1∶2，置于60 ℃下提取2 h，重復提取兩次，在此條件下得到最佳提取效果。在蝦殼、蝦肉和內臟各部位蝦青素提取含量看，蝦殼中蝦青素的含量最高，4個樣地蝦殼中蝦青素含量分別為西海碼頭(45.28±0.12 μg·g-1)、江家灣(38.24±0.14 μg·g-1)、吳家?guī)r頭(46.18±0.23 μg·g-1)、嘍啰山(42.97±0.26 μg·g-1)，4個樣地蝦肉和內臟中也含有少量蝦青素，但是含量遠低于蝦殼中的含量，這也說明了草海小龍蝦蝦青素主要富集在蝦殼中。