郭玉杰，涂濤，邱錦，彤麗格，羅會(huì)穎，姚斌

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籃狀菌JCM12802來(lái)源的高溫葡萄糖淀粉酶性質(zhì)與結(jié)構(gòu)

郭玉杰，涂濤，邱錦，彤麗格，羅會(huì)穎，姚斌

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所，北京 100081

郭玉杰, 涂濤, 邱錦, 等. 籃狀菌Talaromyces leycettanus JCM12802來(lái)源的高溫葡萄糖淀粉酶性質(zhì)與結(jié)構(gòu). 生物工程學(xué)報(bào), 2019, 35(4): 616–625.Guo YJ, Tu T, Qiu J, et al. Characterization and structure of a novel thermostable glucoamylase from Talaromyces leycettanus JCM12802. Chin J Biotech, 2019, 35(4): 616–625.

葡萄糖淀粉酶作為淀粉糖化的關(guān)鍵用酶之一，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥和發(fā)酵工業(yè)等行業(yè)。由于整個(gè)制糖過(guò)程都是在高溫下完成的，因此對(duì)葡萄糖淀粉酶的反應(yīng)溫度和熱穩(wěn)定性有較高要求。本研究從嗜熱籃狀菌JCM12802中克隆到一個(gè)糖苷水解酶第15家族 (GH15) 葡萄糖淀粉酶基因 () 并在畢赤酵母GS115 中實(shí)現(xiàn)異源表達(dá)。重組葡萄糖淀粉酶GA的最適pH為4.5，在75 ℃下表現(xiàn)出最高酶活。GA熱穩(wěn)定性好，65 ℃條件下處理1 h剩余70%以上酶活力；70 ℃處理30 min后仍有43%酶活力。GA有較強(qiáng)的離子抗性和寬泛的底物特異性，GA水解可溶性淀粉、支鏈淀粉、糖原、糊精和普魯蘭的比活力分別為 (255.6± 15.3) U/mg、(342.3±24.7) U/mg、(185.4±12.5) U/mg、(423.3±29.3) U/mg和(65.7±8.1) U/mg。從葡萄糖淀粉酶GA的一級(jí)結(jié)構(gòu)、二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)3個(gè)層面對(duì)其進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)一級(jí)結(jié)構(gòu)中較少的Gly組成和三級(jí)結(jié)構(gòu)中較低的非極性基團(tuán)溶劑可及表面積可能是維持葡萄糖淀粉酶GA溫度穩(wěn)定性的主要原因。綜合其性質(zhì)特點(diǎn)和對(duì)結(jié)構(gòu)的分析，葡萄糖淀粉酶GA在工業(yè)葡萄糖生產(chǎn)中有較大應(yīng)用潛力。

籃狀菌，高溫葡萄糖淀粉酶，克隆表達(dá)，性質(zhì)特點(diǎn)，結(jié)構(gòu)分析

葡萄糖淀粉酶 (EC 3.2.1.3) 又稱糖化酶，它能夠從淀粉糖鏈的非還原末端切下葡萄糖分子，是一種典型的外切酶[1]。葡萄糖淀粉酶在食品、醫(yī)藥和發(fā)酵工業(yè)等行業(yè)都有廣泛應(yīng)用[2-4]，尤其是對(duì)于葡萄糖的生產(chǎn)。葡萄糖的工業(yè)生產(chǎn)主要分為淀粉液化和糖化兩步。首先是高溫α-淀粉酶在95–105 ℃、pH 5.5–6.5的條件下將淀粉分解成寡糖和麥芽糖，降低黏度；然后冷卻降溫到60–65 ℃、調(diào)整pH至4.0–4.5后，添加葡萄糖淀粉酶分解寡糖和麥芽糖，最終生成葡萄糖[5]。工業(yè)生產(chǎn)中所用的α-淀粉酶有極好的溫度穩(wěn)定性，在95–105 ℃條件下能夠快速完成淀粉的液化。但是葡萄糖淀粉酶的最適反應(yīng)溫度相對(duì)較低，在進(jìn)行糖化反應(yīng)之前需要進(jìn)行降溫處理。提高糖化過(guò)程的反應(yīng)溫度不僅可以減少降溫過(guò)程的處理時(shí)間，而且還能夠增加底物溶解度，降低底物黏度，有效降低染菌風(fēng)險(xiǎn)和加快反應(yīng)速率[4]。但是，一直以來(lái)糖化酶的最適反應(yīng)溫度和熱穩(wěn)定性距離期望值還有一定的差距[6-7]，因此高溫葡萄糖淀粉酶的研究一直都備受關(guān)注。

目前，工業(yè)普遍應(yīng)用的葡萄糖淀粉酶主要來(lái)源于黑曲霉、泡盛曲霉和米根霉等絲狀真菌。這些葡萄糖淀粉酶在碳水化合物活性酶 (Carbohydrate- active enzymes, CAZy) 數(shù)據(jù)庫(kù)中屬于GH15家族。在三維結(jié)構(gòu)上，它們通常含有一個(gè)催化域(Catalytic domain, CD) 和一個(gè)淀粉結(jié)合域 (Starch- binding domain, SBD)；兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間通過(guò)富含-糖基化的Linker連接，也有一些葡萄糖淀粉酶只存在催化域[8]。糖化酶的催化區(qū)域是一個(gè)通過(guò)(α/α)6形成的漏斗狀活性中心，主要負(fù)責(zé)底物的水解[9]；淀粉結(jié)合域可以有效地結(jié)合淀粉顆粒協(xié)同催化域水解不溶性底物，它通常位于葡萄糖淀粉酶的C端，但是來(lái)源于稻根霉菌葡萄糖淀粉酶的SBD位于其催化結(jié)構(gòu)域的N端[10]。有關(guān)葡萄糖淀粉酶結(jié)構(gòu)的研究起始較早，當(dāng)前被PDB (Protein Data Bank) 數(shù)據(jù)庫(kù)收錄的葡萄糖淀粉酶晶體結(jié)構(gòu)有很多[11]，但是早期報(bào)道的葡萄糖淀粉酶結(jié)構(gòu)只有催化結(jié)構(gòu)域。Li等[12]對(duì)紅褐肉座菌來(lái)源的葡萄糖淀粉酶HjGA進(jìn)行了晶體結(jié)構(gòu)的解析，成功報(bào)道了第一個(gè)涵蓋了催化域、淀粉結(jié)合域和連接域完整的葡萄糖淀粉酶的晶體結(jié)構(gòu) (2VN4)。近來(lái)，工業(yè)上應(yīng)用最廣泛的3種葡萄糖淀粉酶HrGA、PoGA和AnGA完整的晶體結(jié)構(gòu)也相繼被成功解析并報(bào)道[13]。以上研究主要分析了葡萄糖淀粉酶整體的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及其與催化底物反應(yīng)的關(guān)系，針對(duì)其與溫度穩(wěn)定性相關(guān)的結(jié)構(gòu)分析尚未見(jiàn)報(bào)道。由于高溫葡萄糖淀粉酶資源相對(duì)匱乏和與溫度穩(wěn)定性相關(guān)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)尚不清楚，當(dāng)前提高葡萄糖淀粉酶溫度穩(wěn)定性的研究主要通過(guò)定向進(jìn)化的方法[14-15]。該方法需要建立龐大的突變體庫(kù)，篩選過(guò)程耗時(shí)較長(zhǎng)且工作量大。因此，新穎高溫葡萄糖淀粉酶的基因資源挖掘和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)的分析對(duì)于高溫葡萄糖淀粉酶的研究具有重要意義。

嗜熱真菌是高溫葡萄糖淀粉酶的重要來(lái)源之一[5]，目前報(bào)道的產(chǎn)葡萄糖淀粉酶的嗜熱真菌有籃狀菌屬[16]、嗜熱真菌屬[17]和毛殼菌屬[18]等。JCM12802的最適生長(zhǎng)溫度為40 ℃，屬于典型的嗜熱真菌。該真菌來(lái)源的眾多酶資源已被發(fā)掘和研究，且大多具有較高的溫度特性，例如淀粉酶、木聚糖酶、葡聚糖酶、甘露聚糖酶和果膠酶等[19-23]。本研究中，我們從嗜熱真菌JCM12802基因組中檢索到一個(gè)葡萄糖淀粉酶基因，并命名為。將其成功克隆后在畢赤酵母中進(jìn)行高效異源表達(dá)和基本性質(zhì)研究，發(fā)現(xiàn)其具有較高的反應(yīng)溫度和溫度穩(wěn)定性，在工業(yè)葡萄糖生產(chǎn)中有較大應(yīng)用潛力。最后，我們針對(duì)高溫葡萄糖淀粉酶GA的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)進(jìn)行了初步分析，為今后的突變研究提供了思路。

1 材料與方法

1.1 菌株、載體及試劑

菌株JCM12802購(gòu)自日本微生物保藏中心 (Japan Collection of Microorganisms, JCM)，活化和培養(yǎng)所選用的培養(yǎng)基均為馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基 (PDA)，培養(yǎng)溫度為40 ℃。用于基因克隆的載體為pEASY-T3，宿主菌為大腸桿菌Trans-T1，均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。葡萄糖淀粉酶基因的表達(dá)載體為pPIC9，表達(dá)宿主為畢赤酵母GS115。試驗(yàn)中所用的總RNA 提取試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒分別購(gòu)自天根生化科技有限公司和東洋紡生物科技有限公司；DNA高保真聚合酶FastPfu Fly購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自O(shè)mega，限制性內(nèi)切酶均購(gòu)自NEB。用于酶活測(cè)定的可溶性淀粉、支鏈淀粉、直鏈淀粉、糖原、糊精、普魯蘭酶、α-環(huán)糊精、β-環(huán)糊精、γ-環(huán)糊精等底物均購(gòu)自Sigma-Aldrich。其他常見(jiàn)化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 培養(yǎng)基的配制

實(shí)驗(yàn)中所用的培養(yǎng)基有馬鈴薯葡萄糖固體培養(yǎng)基 (PDA)、馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基 (PDB)、LB液體培養(yǎng)基、LB固體培養(yǎng)基、MD固體培養(yǎng)基、BMGY培養(yǎng)基、BMMY培養(yǎng)基和YPD培養(yǎng)基。其詳細(xì)制備方法可參照文獻(xiàn)[24]。

1.3 基因序列信息的獲取及分析

根據(jù)JCM12802的全基因組測(cè)序結(jié)果，查找到一個(gè)GH15家族葡萄糖淀粉酶基因并命名為，然后對(duì)該基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析。將葡萄糖淀粉酶GA的基因序列通過(guò)Blast (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast/) 檢索同源序列，從而對(duì)該基因的新穎性進(jìn)行評(píng)估，然后提交Softberry (http://linux1.softberry.com/ berry.phtml)，對(duì)基因的內(nèi)含子和外顯子進(jìn)行預(yù)測(cè)。利用Vector NTI Advance 10.0軟件將基因序列翻譯成氨基酸序列后，并分析其編碼蛋白質(zhì)的序列長(zhǎng)度、等電點(diǎn)和分子量等信息。利用SignalP 4.1 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) 預(yù)測(cè)其編碼蛋白質(zhì)的信號(hào)肽序列。

1.4 葡萄糖淀粉酶基因Tlga15A的克隆與畢赤酵母表達(dá)載體構(gòu)建

將菌株JCM12802在40 ℃搖瓶培養(yǎng)活化，48 h后轉(zhuǎn)接以淀粉為唯一碳源的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)3–4 d，12 000 r/min離心收集菌體。根據(jù)總RNA 提取試劑盒使用說(shuō)明提取菌體的總RNA，然后參照東洋紡ReverTra Ace-a-TM kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒方法，將RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。通過(guò)分析基因的全長(zhǎng)序列和編碼的成熟氨基酸序列，去除信號(hào)肽序列后，設(shè)計(jì)分別含有RⅠ和Ⅰ酶切位點(diǎn)的引物GAF (5′-GGGGAAT TCGCACCACAGCCTGTGCTTCCCAGAG-3′) 和GAR (5′-GGGGCGGCCGCCTATCTCCAGGTAT CGTTCTCCGTC-3′)，然后以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將擴(kuò)增產(chǎn)物用RⅠ和Ⅰ雙酶切后連入pPIC9載體轉(zhuǎn)化Trans1-T1大腸桿菌感受態(tài)，挑選陽(yáng)性克隆并測(cè)序驗(yàn)證。

1.5 葡萄糖淀粉酶TlGA的表達(dá)與純化

將經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證正確的表達(dá)載體pPIC9_用限制性內(nèi)切酶Ⅰ線性化處理，電擊轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞中；將轉(zhuǎn)化子涂布組氨酸缺陷型的MD平板于30 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 d，然后挑取48個(gè)單克隆菌落于3 mL BMGY液體培養(yǎng)基中培養(yǎng) (30 ℃、250 r/min)，培養(yǎng)2 d后4 500 r/min離心5 min，棄上清培養(yǎng)基并收集菌體，然后重懸于1.0 mL的 BMMY誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培養(yǎng)2 d。最后，通過(guò)酶活檢測(cè)挑選出活性最高的克隆子進(jìn)行搖瓶放大培養(yǎng)。

將篩選的高酶活轉(zhuǎn)化子用YPD培養(yǎng)基活化后接種于300 mL BMGY液體培養(yǎng)基中，接種量為1% (/)。30 ℃條件下培養(yǎng)48 h后，4 500 r/min離心5 min收集菌體，轉(zhuǎn)入200 mL含有0.5%甲醇的BMMY液體培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，期間每隔12 h補(bǔ)加1 000 μL甲醇，使甲醇終濃度控制在0.5%左右。

培養(yǎng)結(jié)束后，將粗酶液1 2000 r/min離心10 min收集上清液，并用截留分子量為10 kDa的膜包(Vivascience) 濃縮至10 mL，然后于pH 6.5、10 mmol/L檸檬酸-磷酸鹽緩沖液中過(guò)夜透析。將透析處理的酶液通過(guò)陰離子交換層析 (HiTrap Q XL) 進(jìn)行純化，獲得單一組分的目的蛋白。將純化后的蛋白用Endo H (NEB) 處理去除-糖基化修飾。最后，將純化后的蛋白與去除-糖基化修飾的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.6 TlGA的酶活力測(cè)定及性質(zhì)研究

葡萄糖淀粉酶GA活力測(cè)定所使用的底物為1%可溶性淀粉，在由900 μL底物和100 μL的酶液組成的反應(yīng)體系中 (pH 4.5)，75 ℃條件下反應(yīng)30 min，使用3,5-二硝基水楊酸 (DNS) 法檢測(cè)還原糖生成量[25]，每分鐘產(chǎn)生1 μmol葡萄糖所需要的酶量即為一個(gè)酶活力單位，符號(hào)為U/mL。

測(cè)定葡萄糖淀粉酶的最適pH時(shí)，將純化的葡萄糖淀粉酶GA分別置于不同pH的反應(yīng)環(huán)境中，75 ℃條件下反應(yīng)30 min，然后測(cè)定還原糖的生成量，分別計(jì)算不同pH條件下的酶活，其中酶活最高時(shí)對(duì)應(yīng)的pH值即為該酶的最適pH。pH穩(wěn)定性的測(cè)定方法為將純化的酶液調(diào)至在pH 1.0–12.0范圍內(nèi)，37 ℃下孵育1 h，然后于pH 4.5條件下75 ℃反應(yīng)30 min 測(cè)定其剩余酶活，計(jì)算不同pH處理下的相對(duì)剩余酶活。

葡萄糖淀粉酶GA最適溫度測(cè)定方法為將純化的酶用pH 4.5的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液 (50 mmol/L) 稀釋到合適的濃度，添加到相同pH的底物溶液中；分別檢測(cè)其在30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、75 ℃、80 ℃、85 ℃條件下酶活力，其中酶活最高時(shí)的反應(yīng)溫度即為該酶的最適反應(yīng)溫度。將純化的葡萄糖淀粉酶分別在60 ℃、65 ℃和70 ℃條件下孵育2–60 min不同時(shí)間，然后測(cè)定其剩余酶活。以0 ℃處理的樣品為參照 (100%)，分別計(jì)算不同溫度條件下處理不同時(shí)間后樣品的剩余酶活。

1.7 不同金屬離子和化學(xué)試劑對(duì)葡萄糖淀粉酶TlGA活力的影響

Na+、K+、Ag+、Cu2+、Mg2+、Mn2+、Ca2+、Ni2+、Pb2+、Zn2+、Fe3+、Cr3+、SDS、EDTA和-巰基乙醇等金屬離子及化學(xué)試劑對(duì)GA活力的影響。在酶促反應(yīng)體系中加入以上金屬離子和化學(xué)試劑，使其終濃度為5 mmol/L。然后，在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)條件下測(cè)定葡萄糖淀粉酶活力；以未添加任何試劑的反應(yīng)體系為對(duì)照組；最終，計(jì)算金屬離子及化學(xué)試劑對(duì)酶活性的影響，每組試劑設(shè)置3個(gè)平行反應(yīng)。

1.8 TlGA的酶學(xué)動(dòng)力學(xué)及底物特異性研究

用pH 4.5的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液配制濃度為1–10 mg/mL不等的可溶性淀粉，糊化后作為反應(yīng)底物。然后在pH 4.5、75 ℃條件下反應(yīng)5 min并測(cè)定不同底物濃度下的酶活。將酶活數(shù)據(jù)使用GraphPad Prism 5.01進(jìn)行處理分析。

分別選取支鏈淀粉、糖原、普魯蘭、糊精、直鏈淀粉、α-環(huán)糊精、β-環(huán)糊精、γ-環(huán)糊精為底物，用pH 4.5的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液配制濃度為5 mg/mL。將酶液稀釋到合適的濃度后，分別測(cè)定葡萄糖淀粉酶GA對(duì)不同底物在75 ℃條件下的酶活力。以可溶性淀粉為底物時(shí)的酶活為100%，分別計(jì)算其他底物的相對(duì)酶活力。

1.9 TlGA同源建模與結(jié)構(gòu)分析

為了探究葡萄糖淀粉酶GA的高溫機(jī)制和與之對(duì)應(yīng)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，需要通過(guò)同源建模的方法獲得葡萄糖淀粉酶GA三維結(jié)構(gòu)。首先，將GA的氨基酸序列輸入PDB數(shù)據(jù)進(jìn)行檢索；其次，綜合考慮一致性和覆蓋度兩個(gè)指標(biāo)挑選適合的模板；最后，利用軟件Discovery Studio 2017進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)和構(gòu)建。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖淀粉酶基因Tlga15A的克隆與序列分析

從JCM12802成功克隆葡萄糖淀粉酶編碼基因并提交GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，序列注冊(cè)號(hào)為MH730064。該基因全長(zhǎng)為2 186 bp，包含4個(gè)內(nèi)含子，長(zhǎng)度分別為88 bp、57 bp、66 bp和64 bp。葡萄糖淀粉酶基因的cDNA全長(zhǎng)為1 911 bp，能夠編碼636個(gè)氨基酸。對(duì)其編碼的氨基酸序列進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)分析結(jié)果表明，其N(xiāo)端的前20個(gè)氨基酸殘基是其信號(hào)肽序列。成熟肽部分的理論分子量為63.3 kDa，預(yù)測(cè)等電點(diǎn)為4.76。網(wǎng)站預(yù)測(cè)有3個(gè)潛在的-糖基化修飾位點(diǎn)，分別為N183、N443和N572。葡萄糖淀粉酶GA的氨基酸序列與絲衣霉來(lái)源的葡萄糖淀粉酶GAD95639最為相似，一致性為76%；與已報(bào)道過(guò)性質(zhì)的葡萄糖淀粉酶P69328[26]的序列一致性為70.6%；并與來(lái)源于泡盛曲霉的葡萄糖淀粉酶晶體結(jié)構(gòu)1GAI_A的序列一致性為75%。

2.2 葡萄糖淀粉酶TlGA同源建模與結(jié)構(gòu)分析

在PDB數(shù)據(jù)庫(kù)中，GA與泡盛曲霉來(lái)源的葡萄糖淀粉酶晶體結(jié)構(gòu)1GAI_A有最高的序列一致性 (75%)，但是覆蓋度僅有74%；而與黑曲霉來(lái)源的葡萄糖淀粉酶晶體結(jié)構(gòu)6FRV_A的序列一致性為70%，其覆蓋度可高達(dá)95%。因此，我們以1GAI_A和6FRV_A同時(shí)作為模板進(jìn)行同源建模。從結(jié)構(gòu)上來(lái)看 (圖1)，GA由2個(gè)結(jié)構(gòu)域組成：底物結(jié)合域 (SBD) 和催化結(jié)構(gòu)域 (CD)，二者之間為連接域 (Linker)。從序列比對(duì)的結(jié)果來(lái)看，GA的底物結(jié)合域?qū)儆贑BM20，位于葡萄糖淀粉酶的C-末端。該區(qū)域在序列上富含苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸等芳香族氨基酸殘基，其二級(jí)結(jié)構(gòu)主要是由7段β-折疊片反向平行折疊形成的β-卷筒結(jié)構(gòu)。葡萄糖淀粉酶催化域含有440個(gè)氨基酸殘基，是由13股α-螺旋組成的 (α/α)6桶狀結(jié)構(gòu)。Glu188和Glu409組成葡萄糖淀粉酶催化中心，Glu188作為質(zhì)子供體將H+傳遞給淀粉鏈中易斷裂鍵的糖苷鍵上形成含氧碳正離子，然后水分子在Glu409協(xié)助下發(fā)起親核攻擊，從而使糖苷鍵斷裂。葡萄糖淀粉酶的連接域是一段高度-糖基化的多肽鏈，長(zhǎng)度為73個(gè)氨基酸。該區(qū)域富含Ser和Thr殘基并且容易發(fā)生-糖基化。糖基化作用能夠有效穩(wěn)定蛋白質(zhì)骨架，避免蛋白酶水解，增強(qiáng)糖化酶親和力和增加糖化酶熱穩(wěn)定性等作用。

圖1 TlGA的三維結(jié)構(gòu)

2.3 重組葡萄糖淀粉酶TlGA的表達(dá)和純化

將轉(zhuǎn)化了基因的GS115畢赤酵母菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，獲得粗酶液后進(jìn)行濃縮、純化和SDS-PAGE分析。結(jié)果顯示GA的目的條帶大小為75 kDa (圖2A)，Endo H酶處理后，目的條帶有輕微減小，但仍舊比63.3 kDa的理論分子量大。可能的原因是連接催化域 (CD) 和底物結(jié)合域 (CBM) 的Linker區(qū)存在大量的糖基化位點(diǎn)，從而導(dǎo)致電泳條帶遠(yuǎn)大于理論分子量。為了進(jìn)一步確認(rèn)純化得到的蛋白是編碼葡萄糖淀粉酶GA的目標(biāo)蛋白，將條帶進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果顯示有5個(gè)片段能與目的序列完全匹配，其覆蓋度為39% (圖2B)。質(zhì)譜結(jié)果充分證明了75 kDa附近的蛋白條帶是目的蛋白。

2.4 酶學(xué)性質(zhì)的分析

與多數(shù)真菌來(lái)源的葡萄糖淀粉酶相似，GA在酸性條件下有較高的酶活力。其最適pH為4.5 (圖3A)，在pH 3.0–5.5范圍內(nèi)保持40%以上的酶活力；在pH 7.0的中性條件和堿性條件下葡萄糖淀粉酶完全喪失活力。葡萄糖淀粉酶GA在較寬的pH范圍內(nèi)均能保持穩(wěn)定，在pH 3.0–9.0范圍內(nèi)37 ℃處理1 h，都有80%以上的剩余酶活 (圖3B)。在40–75 ℃的溫度范圍內(nèi)，重組的葡萄糖淀粉酶GA隨著反應(yīng)溫度升高，糖化酶活性逐步增加，75 ℃時(shí)達(dá)到最高酶活力；當(dāng)反應(yīng)溫度超過(guò)75 ℃時(shí)，酶活驟降；反應(yīng)溫度為80 ℃時(shí)，僅有不到20%的酶活 (圖3C)。GA具有較好的熱穩(wěn)定性，65 ℃處理1 h，酶活損失在30%以內(nèi)；70 ℃條件下處理30 min，仍有43%的剩余酶活；75 ℃條件下處理5 min的剩余酶活約為40% (圖3D)。

2.5 金屬離子及化學(xué)試劑對(duì)酶活的影響

盡管很多α-淀粉酶都存在金屬離子激活效應(yīng)，但是一些常見(jiàn)的離子對(duì)葡萄糖淀粉酶GA促進(jìn)作用并不明顯。Na+、Ca2+、Cu2+和Zn2+對(duì)葡萄糖淀粉酶有一定的促進(jìn)作用；而Ag+(62.2%)、Mn2+(82.2%)、-Mercaptoeth (61.8±0.98)、EDTA (89.7±1.41) 和SDS (24.3±0.75) 能有效抑制其酶活力 (表1)。

2.6 底物特異性及動(dòng)力學(xué)分析

純化的葡萄糖淀粉酶GA以可溶性淀粉為底物時(shí)，在75 ℃、pH 4.5的條件下的比活力為(255.6±15.3) U/mg；m值為(1.79±0.11) mg/mL，max值為(276.0±3.5) μmol/(min·mg)。葡萄糖淀粉酶GA不僅可以高效地催化可溶性淀粉的水解，對(duì)其他底物也表現(xiàn)出較高的水解活性。對(duì)支鏈淀粉、糖原、糊精、普魯蘭的比活力分別為(342.3±24.7) U/mg、(185.4±12.5) U/mg、(423.3±29.3) U/mg和(65.7±8.1) U/mg (表2)。對(duì)于直鏈淀粉、α-環(huán)糊精、β-環(huán)糊精、γ-環(huán)糊精等底物未檢測(cè)到活性。

圖3 TlGA的基本酶學(xué)性質(zhì)(A：最適pH；B：pH穩(wěn)定性；C：最適溫度；D：溫度穩(wěn)定性)

表1 金屬離子及化學(xué)試劑對(duì)TlGA活性的影響

表2 TlGA對(duì)不同底物的Km和比活力

3 討論

工業(yè)制糖過(guò)程通常是在較高的溫度條件下完成的，因此要求葡萄糖淀粉酶要有較高的溫度穩(wěn)定性。目前黑曲霉的葡萄糖淀粉酶AnGA應(yīng)用最為廣泛[4,27]，其最適反應(yīng)溫度為65–70 ℃，通常在60 ℃條件下能夠保持穩(wěn)定[4]。在本研究中，從嗜熱真菌JCM12802中獲得了一個(gè)高溫葡萄糖淀粉酶GA，其最適溫度為75 ℃，65 ℃處理1 h仍剩余70%以上的酶活，在最適溫度和溫度穩(wěn)定性上優(yōu)于當(dāng)前工業(yè)上廣泛應(yīng)用的葡萄糖淀粉酶。通常真菌來(lái)源的葡萄糖淀粉酶溫度穩(wěn)定性較差[8]，而嗜熱真菌一直以來(lái)都是高溫糖化酶的重要來(lái)源之一[28]。Nielsen等從嗜熱真菌克隆了一個(gè)耐熱葡萄糖淀粉酶基因，并在黑曲霉中進(jìn)行了表達(dá)[16]。該葡萄糖淀粉酶的最適溫度為70 ℃，低于來(lái)源的葡萄糖淀粉酶GA (75 ℃)；但是二者在溫度穩(wěn)定性方面差距并不明顯，可能的原因是由表達(dá)宿主差異導(dǎo)致糖基化程度不同造成的。結(jié)合高溫葡萄糖淀粉酶GA的性質(zhì)特點(diǎn)，以低溫葡萄糖淀粉酶AmyT1[29]和中溫葡萄糖淀粉酶HjGA[12]為參照，從蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)、二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)這3個(gè)層面進(jìn)行了比較分析。

分析葡萄糖淀粉酶一級(jí)結(jié)構(gòu)時(shí)，主要從特殊氨基酸組成、-糖基化位點(diǎn)和形成二硫鍵數(shù)目這3個(gè)特點(diǎn)進(jìn)行比較分析。Arg和Pro在3種不同葡萄糖淀粉酶序列中出現(xiàn)的頻率差異不大，但是Gly在GA中所占的比例明顯低于HjGA和AmyT1 (表3)。Gly作為柔性最強(qiáng)的氨基酸，它在蛋白分子中出現(xiàn)的頻率與整個(gè)蛋白分子的柔性密切相關(guān)，這在以往的研究中已被廣泛證實(shí)[30]。根據(jù)報(bào)道，蛋白的糖基化程度和二硫鍵數(shù)目也與其穩(wěn)定性密切相關(guān)[31,32]；我們對(duì)其進(jìn)行了比較分析，發(fā)現(xiàn)在不同葡萄糖淀粉酶分子的-糖基化位點(diǎn)與其溫度特點(diǎn)沒(méi)有明顯規(guī)律；但是在二硫鍵組成方面，低溫葡萄糖淀粉酶AmyT1和中溫葡萄糖淀粉酶HjGA均有4對(duì)二硫鍵，而高溫葡萄糖淀粉酶GA僅有3對(duì)。眾所周知，二硫鍵是維持蛋白酶穩(wěn)定的重要作用力；在蛋白的熱穩(wěn)定性改良時(shí)，引入二硫鍵也是一個(gè)重要的策略。但是在高溫葡萄糖淀粉酶GA材料中二硫鍵缺失的生物學(xué)意義尚不清楚。因此，從氨基酸組成上來(lái)看，低頻率的Gly是葡萄糖淀粉酶GA高溫耐受性的重要原因之一。

表3 葡萄糖淀粉酶TlGA、HjGA、AmyT1的結(jié)構(gòu)比較

蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)原件主要包括α-螺旋、β折疊和無(wú)規(guī)則卷曲，蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的組成往往會(huì)影響蛋白整體的穩(wěn)定性[30]。因此，我們對(duì)高溫葡萄糖淀粉酶GA、中溫葡萄糖淀粉酶HjGA和低溫葡萄糖淀粉酶AmyT1的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)。從結(jié)果可以看出，高溫葡萄糖淀粉酶GA在二級(jí)結(jié)構(gòu)組成和占比上與HjGA和AmyT1沒(méi)有明顯差異 (表3)?？赡艿脑蚴?種葡萄糖淀粉酶在序列上有很高的相似性，從而其二級(jí)結(jié)構(gòu)的差異也不明顯。因此，從二級(jí)結(jié)構(gòu)層面并不能很好地解釋葡萄糖淀粉酶GA的高溫機(jī)制。

在三級(jí)結(jié)構(gòu)層面上，我們主要分析不同葡萄糖淀粉酶分子的溶劑可及表面積并比較它們的差異。與中溫葡萄糖淀粉酶HjGA和低溫葡萄糖淀粉酶AmyT1相比，高溫葡萄糖淀粉酶GA的非極性殘基的溶劑可及表面積明顯小于HjGA和AmyT1 (表3)。疏水作用力是維持蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的主要因素，因此，過(guò)多的疏水殘基暴露在溶劑環(huán)境是影響蛋白穩(wěn)定的重要原因。非極性殘基的溶劑可及表面積越小，整個(gè)蛋白分子在三級(jí)結(jié)構(gòu)上越穩(wěn)定。因此，從氨基酸組成上來(lái)看，較小的非極性殘基的溶劑可及表面積是葡萄糖淀粉酶GA高溫耐受性的又一重要原因。

綜上所述，本研究獲得了一個(gè)新穎的高溫葡萄糖淀粉酶基因，并在畢赤酵母中成功進(jìn)行了高效表達(dá)。該葡萄糖淀粉酶有較高的最適反應(yīng)溫度和溫度穩(wěn)定性，同時(shí)對(duì)普魯蘭有較好的降解活性。這些特點(diǎn)使其在工業(yè)制糖中有很好的應(yīng)用前景。另外，我們分析了GA的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，對(duì)葡萄糖淀粉酶的分子改造具有重要的指導(dǎo)意義。

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Characterization and structure of a novel thermostable glucoamylase fromJCM12802

Yujie Guo, Tao Tu, Jin Qiu, Lige Tong, Huiying Luo, and Bin Yao

Feed Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China

Glucoamylase is a critical ingredient for saccharification in the starch decomposition, and widely used in food, pharmaceutical and fermentation industries. Glucoamylases are usually thermostable and have peak activities at high temperature, as required for the industrial process of glucose production. In this study, a glucoamylase gene belonging to the glycoside hydrolase (GH) family 15,, was cloned fromJCM12802, and successfully expressed inGS115. Recombinant glucoamylaseGA showed optimal activities at pH 4.5 and 75 °C. The result of thermostability analysis showed thatGA retained above 70% activity after incubating for 1 h at 65 °C, and 43% residual activity after 30 min at 70 °C. Moreover,GA had high resistance to most metal ions and chemical reagents tested. Various starch substrates could be hydrolyzed byGA, including soluble starch (255.6±15.3) U/mg, amylopectin (342.3± 24.7) U/mg, glycogen (185.4±12.5) U/mg, dextrin (423.3±29.3) U/mg and pullulan (65.7±8.1) U/mg. The primary, secondary and tertiary structures of glucoamylase were further analyzed. The low ratio of Glyin the primary structure and low exposed nonpolarity solvent accessible surface in the tertiary structure may be the main reasons forGA’s thermostability. These results show thatGA is great promising for potential use in the commercial production of glucose syrups. Moreover, this research will provide knowledge and innovating ideas for the improvement of glucoamylase thermostability.

,thermostable glucoamylase, cloning and expression, characterization, structural analysis

10.13345/j.cjb.180330

August 15, 2018;

November 7, 2018

The Collaborative Innovation Project of Chinese Academy of Agricultural Sciences (No. CAAS-463 XTCX2016011-04-5).

Bin Yao. Tel: +86-10-82106065; E-mail:binyao@caas.cn

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院協(xié)同創(chuàng)新項(xiàng)目 (No. CAAS-463 XTCX2016011-04-5) 資助。

2018-11-26

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20181122.1104.002.html

(本文責(zé)編 郝麗芳)