張杰，劉奎艷，范鑫，李洋，張國(guó)財(cái)

(1.東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150040；2.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，哈爾濱 150040)

蛹蟲草藥性作用溫和，具有與冬蟲夏草相似的活性成分[1]。因有提高免疫能力、保肺益腎、促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡[2]等藥效作用而被大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)?，F(xiàn)階段蛹蟲草生產(chǎn)大多采用固體培養(yǎng)模式[3]，當(dāng)蛹蟲草子實(shí)體采收后，剩余的培養(yǎng)殘基被廢棄，而培養(yǎng)殘基中仍含有大量的菌絲體和營(yíng)養(yǎng)成分沒(méi)有得到很好地利用，造成資源的浪費(fèi)。動(dòng)物生產(chǎn)上常用抗生素來(lái)預(yù)防控制各類疾病，而抗生素的長(zhǎng)期大量使用已使病原菌產(chǎn)生耐藥性，導(dǎo)致防控疾病效果不佳且給人類健康造成影響[4]。戴朝洲等[5]研究認(rèn)為，蟲草真菌發(fā)酵中草藥培養(yǎng)基作為原料飼喂育肥豬，能夠提高育肥豬的日增重、屠宰率和瘦肉率、降低料肉比和背膘厚度；楊迪[6]研究認(rèn)為，中草藥為綠色安全的飼料添加劑，經(jīng)過(guò)發(fā)酵后不但能使有效成分充分釋放，提高原料利用率，而且發(fā)酵代謝產(chǎn)生的新物質(zhì)，能增加更豐富的藥物作用。而其他蟲草飼料添加劑對(duì)保育仔豬[7]和巴馬小型豬[8]日增重和飼料轉(zhuǎn)化率也具有積極影響，蟲草飼料添加劑對(duì)豬的免疫增強(qiáng)主要表現(xiàn)在降低腹瀉率，提高血液抗體濃度[5]和免疫蛋白的濃度[9]，改善機(jī)體抗氧化能力[7]等方面。

硒是人類動(dòng)物機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育必需的微量元素之一，缺硒時(shí)，動(dòng)物體內(nèi)細(xì)胞抗過(guò)氧化物毒性能力降低，細(xì)胞被過(guò)氧化物破壞，出現(xiàn)水腫、出血，滲出性素質(zhì)，肝細(xì)胞壞死，脾臟纖維性萎縮，肌肉不正常，心肌變性。在飼料原料中添加無(wú)機(jī)硒或富硒黃粉蟲，能有效提高飼料中硒的含量而從根本上解決動(dòng)物缺硒癥狀,并且有效提高動(dòng)物的繁殖性能[10-11]。研究表明，無(wú)機(jī)硒在腸道吸收是被動(dòng)的，而類似于硒蛋氨酸等有機(jī)形式的硒是主動(dòng)吸收的,有機(jī)硒更有利于血液中硒含量穩(wěn)定，維持硒在肌肉的沉積量[12]。而黃粉蟲中的有機(jī)硒相比無(wú)機(jī)硒(亞硒酸鈉)更安全，動(dòng)物吸收效果更好[13]。此外，黃粉蟲還可提供豐富的粗蛋白[14]及粗纖維物質(zhì)。

本研究利用經(jīng)采收后的蛹蟲草培養(yǎng)殘基和富硒黃粉蟲，加以豆粕、生物飼料發(fā)酵劑進(jìn)行發(fā)酵的方法，制成富硒蟲草發(fā)酵飼料。通過(guò)飼料中各成份含量測(cè)量及指標(biāo)測(cè)定，進(jìn)一步優(yōu)化飼料配比及培養(yǎng)條件，很大程度上降低了生產(chǎn)成本，為其在飼料工業(yè)、養(yǎng)殖行業(yè)中規(guī)模化應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象

蛹蟲草培養(yǎng)殘基：實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的蛹蟲草子實(shí)體采收后，剩余的培養(yǎng)殘基。

黃粉蟲(Tenebriomolitor)：實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品

環(huán)己烷、硝酸、高氯酸、亞硒酸鈉、磷酸、考馬斯亮藍(lán)G-250、正辛醇、丙酮、氫氧化鉀、硫酸、偏釩酸銨、鉬酸銨、鹽酸、高碘酸鈉、醋酸銨、冰醋酸、乙酰丙酮、高碘酸鈉、鼠李糖、苯酚。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑

DAN 試劑(1.0g/L)：此試劑在暗室內(nèi)配制。稱取DAN(純度95%～98%)200mg加入帶蓋錐形瓶中，加入0.1mol/L 鹽酸200 mL，振搖約15min使其全部溶解。加入約40mL環(huán)己烷，繼續(xù)振蕩5min。將此液倒入塞有玻璃棉(或脫脂棉)的分液漏斗中，待分層后濾去環(huán)己烷層，收集DAN溶液層，反復(fù)用環(huán)己烷純化直至環(huán)己烷中熒光降至最低時(shí)為止(約純化5～6 次)。將純化后的DAN溶液儲(chǔ)于棕色瓶中，加入約1cm厚的環(huán)己烷覆蓋表層，至冰箱內(nèi)保存。必要時(shí)在使用前再以環(huán)己烷純化一次。

EDTA溶液(0.2mol/L)：稱取EDTA二鈉鹽37g，加水并加熱至完全溶解，冷卻后稀釋至500mL。

考馬斯亮藍(lán)G-250溶液：稱取0.10g考馬斯亮藍(lán)G-250，溶于50mL 95%乙醇后，加入100mL 85%磷酸，并用水稀釋至1000mL，過(guò)濾制得考馬斯亮藍(lán)G-250溶液，避光待用。

釩鉬酸銨顯色劑：取偏釩酸銨1.25g，加200mL水，加熱溶解，冷卻后再加入250mL硝酸，另取鉬酸銨25g，加水400mL，加熱溶解，在冷卻條件下，將兩種溶液混合，用水定容至1L，避光保存。

高碘酸鈉試劑：將0.015mol高碘酸鈉溶于1000mL 0.12mol/L的HCL溶液中。

Nash試劑：稱取150g醋酸銨，加3mL冰醋酸，2mL乙酰丙酮，加水定容至1000mL。

2 方法

2.1 蛹蟲草培養(yǎng)殘基處理

選用實(shí)驗(yàn)室中培養(yǎng)蛹蟲草子實(shí)體采收后的剩余培養(yǎng)殘基，在60℃烘箱中烘干后，用粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎。

2.2 黃粉蟲富硒飼養(yǎng)

2.2.1 黃粉蟲飼養(yǎng)。選取黃粉蟲幼蟲(身長(zhǎng)約2cm)，飼喂自配飼料，飼養(yǎng)溫度約為21～23℃，篩糞頻率5～7 天/次。黃粉蟲飼料配方：麥麩70%，玉米粉24%，大豆粉5%，奶粉1%。在黃粉蟲飼料中分別添加三組不同含量無(wú)機(jī)硒，分別為Se1=15mg/kg，Se2=25mg/kg，Se3=30mg/kg。無(wú)機(jī)硒采用亞硒酸鈉，將其溶于水中，與飼料攪拌均勻。

2.2.2 硒含量測(cè)定。分別取已富硒飼養(yǎng)10、20、30d的黃粉蟲，饑餓3d，速凍致死后，在80℃條件下烘干，密封保存?zhèn)溆谩Ｈ?.5g樣品，采用二胺基萘熒光光度法，參照GB/T 13883-2008測(cè)定硒含量。

2.3 富硒蟲草飼料的制作

2.3.1 不同原料配比的飼料發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。蛹蟲草培養(yǎng)殘基和黃豆豆粕共100g，兩者配比分別為培養(yǎng)殘基60g、豆粕40g，培養(yǎng)殘基70g、豆粕30g，培養(yǎng)殘基80g、豆粕20g，培養(yǎng)殘基90g、豆粕10g，培養(yǎng)殘基100g，豆粕0g。各添加10g富硒黃粉蟲(硒含量為0.3mg/kg)，用100mg/kg的生物飼料發(fā)酵劑進(jìn)行發(fā)酵，水分為30%左右。密封發(fā)酵5～7d，避免陽(yáng)光直射。

2.3.2 不同富硒方式的飼料發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)分3組：

第一組(不添加硒)：90g蛹蟲草培養(yǎng)殘基，10g黃豆豆粕。分別用60、80、100mg/kg的生物飼料發(fā)酵劑進(jìn)行發(fā)酵，水分為30%左右。密封發(fā)酵5～7d，避免陽(yáng)光直射。

第二組(有機(jī)硒)：90g蛹蟲草培養(yǎng)殘基，10g富硒黃粉蟲(硒含量為0.3mg/kg)，10g黃豆豆粕。分別用 60、80、100mg/kg的生物飼料發(fā)酵劑進(jìn)行發(fā)酵，水分為30%左右。密封發(fā)酵5～7d，避免陽(yáng)光直射。

第三組(無(wú)機(jī)硒)：90g蛹蟲草培養(yǎng)殘基，亞硒酸鈉(調(diào)整硒含量為0.3mg/kg)，10g黃豆豆粕。分別用 60、80、100mg/kg的生物飼料發(fā)酵劑進(jìn)行發(fā)酵，水分為30%左右。密封發(fā)酵5～7d，避免陽(yáng)光直射。

2.4 富硒蟲草飼料中主要物質(zhì)含量測(cè)定

2.4.1 粗蛋白含量的測(cè)定。稱取0.3g樣品，置于預(yù)冷的研缽中，分次加入5mL預(yù)冷的0.1mol/L(pH=7)磷酸緩沖液，研磨后轉(zhuǎn)入離心管中，12000r/min離心10min，上清液為樣品提取液。采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法測(cè)定粗蛋白含量。

2.4.2 粗纖維含量的測(cè)定。將飼料在60℃干燥箱中烘干2h，用粉碎機(jī)磨成粉末。粗纖維含量的測(cè)定參照GB/T 5009.10-2003。

2.4.3 總磷含量的測(cè)定。總磷含量的測(cè)定采用鉬酸銨分光光度法，參照GB11893-89。

2.4.4 銅含量的測(cè)定。銅含量的測(cè)定采用原子吸收光譜法，參照GB/T13885-2017。

2.4.5 水分含量的測(cè)定

預(yù)處理：稱取10g飼料，在130℃干燥箱中烘干10min，烘干結(jié)束后，于室溫下冷卻2h以上，然后用粉碎機(jī)粉碎。

稱取5g已粉碎好的試樣，采用直接干燥法參照GB/T 6435-2014，通過(guò)試樣干燥損失的質(zhì)量計(jì)算水分含量。

2.4.6 蟲草酸含量的測(cè)定。取飼料于60℃干燥箱中烘干2h，采用比色法測(cè)定蟲草酸含量[15]。

2.4.7 蟲草多糖含量的測(cè)定。取飼料于60℃干燥箱中烘干2h，稱取烘干后樣品0.50g，加入20mL水，在微波爐中以中火(P50)處理3.5min(將瓶塞放在瓶口上，但不要塞緊)。將處理過(guò)的樣品溶液過(guò)濾，取5mL濾液加入50mL離心管中，采用乙醇沉淀法提取蟲草多糖、硫酸-苯酚法[16]測(cè)定多糖含量。

2.5 添加不同劑量生物飼料發(fā)酵劑的飼料中pH測(cè)定

稱取10g發(fā)酵好的飼料，加100mL蒸餾水，放入4℃冰箱中保存，浸泡24h后取出。過(guò)濾取得濾液，用pH計(jì)測(cè)量濾液的pH值。

3 結(jié)果與分析

3.1 黃粉蟲飼養(yǎng)的最適硒添加量及最適飼養(yǎng)天數(shù)

在黃粉蟲飼料中添加亞硒酸鈉(硒含量分別為Se1=15mg/kg，Se2=25mg/kg，Se3=30mg/kg)，當(dāng)飼養(yǎng)時(shí)間為10、20、30d時(shí)，取黃粉蟲測(cè)定富硒量，結(jié)果如表1所示。

表1 不同硒添加量的黃粉蟲富硒量

由表1可知，黃粉蟲富硒量隨著添加的無(wú)機(jī)硒濃度的增高而增加，富集量也與時(shí)間呈正相關(guān)。從時(shí)間上來(lái)看，在富硒飼養(yǎng)10d時(shí)，體內(nèi)已富集一定量的硒且前10天的富硒速度最快。在飼養(yǎng)20d時(shí)，幼蟲富硒量明顯多于第10d。在飼喂30d時(shí)，富硒量仍有增加，但富硒速度減慢。黃粉蟲幼蟲在飼養(yǎng)30天后大多數(shù)發(fā)育為成蟲，硒含量大大下降。從硒添加量上來(lái)看，黃粉蟲幼蟲富硒范圍局限于15～30 mg/kg的硒添加量，添加量過(guò)低時(shí)富硒量不明顯,過(guò)高則會(huì)引起幼蟲大量死亡。當(dāng)硒的添加量為30mg/kg，飼養(yǎng)天數(shù)為30d時(shí)，黃粉蟲幼蟲體內(nèi)富集的硒含量最高為8.95mg/kg，且沒(méi)有發(fā)現(xiàn)幼蟲富硒量下降現(xiàn)象。因此該實(shí)驗(yàn)硒的最適添加量為30mg/kg，最適飼養(yǎng)天數(shù)為30d。

3.2 飼料主要原料的最佳配比

圖1 不同原料配比對(duì)飼料中蟲草多糖的影響

圖2 不同原料配比對(duì)飼料中蟲草酸的影響

圖3 不同原料配比對(duì)飼料中粗蛋白的影響

圖1～圖3中a、b、c、d、e分別表示飼料中蛹蟲草培養(yǎng)殘基和黃豆豆粕的配比，分別是培養(yǎng)殘基60g、豆粕40g，培養(yǎng)殘基70g、豆粕30g，培養(yǎng)殘基80g、豆粕20g，培養(yǎng)殘基90g、豆粕10g，培養(yǎng)殘基100g，豆粕0g。可知，飼料中蛹蟲草培養(yǎng)殘基的量越多，飼料中蟲草多糖及蟲草酸含量越高，而粗蛋白含量越低。當(dāng)飼料中不添加黃豆豆粕時(shí)，飼料的粗蛋白含量不符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。因此，可得出飼料中蛹蟲草培養(yǎng)殘基和黃豆豆粕的最佳配比是培養(yǎng)殘基90g，豆粕10g。

3.3 蟲草飼料中主要成分的測(cè)定結(jié)果

3.3.1 硒含量的測(cè)定結(jié)果

圖4 不同生物飼料發(fā)酵劑添加量對(duì)3組飼料含量的影響

圖4中圖示1、2、3，分別表示第一組、第二組、第三組飼料。由圖中可知，第一組飼料的硒含量小于第二組、第三組飼料的硒含量，且差值較大。第一組飼料硒含量最大值為0.08mg/kg，第二組和第三組飼料的最大值分別為0.343mg/kg和0.372mg/kg。豬飼料的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)硒含量為≦0.5mg/kg。3組飼料硒含量均符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。因此，在飼料原料中添加無(wú)機(jī)硒或富硒黃粉蟲，能有效提高飼料中硒的含量。而黃粉蟲中的有機(jī)硒相比無(wú)機(jī)硒(亞硒酸鈉)更安全，動(dòng)物吸收效果更好。

3.3.2 水分測(cè)定結(jié)果

圖5 不同生物飼料發(fā)酵劑添加量對(duì)3組飼料水分含量的影響

由圖5可知，三組飼料的水分含量差值不大，最大值為11.4%。豬飼料的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)水分含量為≦11.5%，3組飼料水分含量均符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。飼料的水分含量與發(fā)酵時(shí)加水量有關(guān)，發(fā)酵時(shí)使原料的水分含量保持在30%左右，發(fā)酵后的飼料水分含量較適宜。

3.3.3 粗纖維含量測(cè)定結(jié)果

圖6 不同生物飼料發(fā)酵劑添加量對(duì)3組飼料粗纖維含量的影響

由圖6可知，第二組飼料中粗纖維含量明顯高于其它兩組，而第一組和第三組飼料的粗纖維含量相差不大。第二組飼料中粗纖維含量的最大值為52mg/g。豬飼料的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)粗纖維含量為<7%，3組飼料粗纖維含量均符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。第二組飼料加入了富硒黃粉蟲，使飼料的粗纖維含量提高。因此，飼料中添加黃粉蟲可增加粗纖維含量。

3.3.4 粗蛋白含量測(cè)定結(jié)果

圖7 不同生物飼料發(fā)酵劑添加量對(duì)3組飼料粗蛋白含量的影響

由圖7可知，第二組飼料的粗蛋白含量高于其它兩組，粗蛋白含量最大值為140.8mg/g。第一組和第三組飼料粗蛋白含量最大值分別為118.8mg/g和115.1mg/g。豬飼料的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)粗纖維含量為≧13%，只有第二組飼料的粗蛋白含量符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。第二組飼料添加的黃粉蟲的蛋白質(zhì)含量較高，提高了第二組飼料的粗蛋白含量。因此，飼料中添加黃粉蟲可增加蛋白質(zhì)含量。

3.3.5 銅含量測(cè)定結(jié)果

圖8 不同生物飼料發(fā)酵劑添加量對(duì)3組飼料銅含量的影響

由圖8可知，3組飼料中銅含量差值不大，銅含量最大值為12.08mg/kg。豬飼料的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)銅含量為≦35mg/kg，3組飼料銅含量均符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。

3.3.6 總磷含量測(cè)定結(jié)果

圖9 不同生物飼料發(fā)酵劑添加量對(duì)3組飼料總磷含量的影響

如圖9所示，3組飼料中總磷含量差值不大，最小值為6.8mg/g，最大值為8mg/g。豬飼料的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)總磷含量為≧0.35%，3組飼料總磷含量均符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。

3.3.7 蟲草酸含量測(cè)定結(jié)果

圖10 不同生物飼料發(fā)酵劑添加量對(duì)硒蟲草飼料蟲草酸含量的影響

由圖10可知，3組飼料中蟲草酸含量無(wú)明顯差異，最大值為19.37mg/g。在蛹蟲草子實(shí)體采收后，蛹蟲草培養(yǎng)殘基中仍含有一定含量的蟲草酸，經(jīng)過(guò)生物飼料發(fā)酵劑的發(fā)酵，飼料中含有蟲草酸，可使飼喂的動(dòng)物提高免疫力，使動(dòng)物具有良好的生長(zhǎng)性狀。

3.3.8 蟲草多糖含量測(cè)定結(jié)果

圖11 不同生物飼料發(fā)酵劑添加量對(duì)3組飼料蟲草多糖含量的影響

由圖11可知，3組飼料中蟲草酸含量無(wú)明顯差異，最大值為28.47mg/g。

3.3.9 pH值測(cè)定結(jié)果

圖12 不同生物飼料發(fā)酵劑添加量對(duì)3組飼料pH的影響

pH能反應(yīng)飼料是否得到了很好的保存及其被腐敗菌分解的程度，飼料的pH越低，品質(zhì)越優(yōu)良。由圖12可知，3組飼料中，當(dāng)生物飼料發(fā)酵劑的添加量為100mg/kg時(shí)，pH都達(dá)到最低。因此，生物飼料發(fā)酵劑的最適添加量應(yīng)為100mg/kg。

4 結(jié)論

按不同原料配比(60g培養(yǎng)殘基、40g豆粕，70g培養(yǎng)殘基、30g豆粕，80g培養(yǎng)殘基、20g豆粕，90g培養(yǎng)殘基、10g豆粕，100g培養(yǎng)殘基、0g豆粕)，以飼料中蟲草多糖、蟲草酸和粗蛋白含量為指標(biāo)，確定飼料的原料最佳配比為90g蛹蟲草培養(yǎng)殘基，10g黃豆豆粕和10g富硒黃粉蟲(硒含量為0.3mg/kg)。再按不同富硒方式、不同量(60、80、100mg/kg)生物飼料發(fā)酵劑進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，確定了生物飼料發(fā)酵劑的最佳添加量為100mg/kg。也就是說(shuō)，本研究新研發(fā)的富硒蟲草飼料的最佳配方為：90g蛹蟲草培養(yǎng)殘基，10g黃豆豆粕和10g富硒黃粉蟲(硒含量為0.3mg/kg)，生物飼料發(fā)酵劑含量100mg/kg。此時(shí)，飼料中硒、粗蛋白、粗纖維、總磷、銅、水分含量均符合豬飼料國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)含量，明顯看出采用富硒黃粉蟲的有機(jī)富硒方式的優(yōu)點(diǎn)，且保留了一定量的蛹蟲草活性物質(zhì)(蟲草多糖含量為28.47mg/g，蟲草酸含量為19.37mg/g)，在飼料工業(yè)、養(yǎng)殖業(yè)領(lǐng)域均有廣闊的應(yīng)用前景和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。