張智，楊柳，尹文哲，高群

(1.東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱 150040；2. 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)，哈爾濱 150086)

骨碎補(bǔ)是水龍骨科(Polypodiaceae)植物槲蕨 [Drynariafortunei(Kunze) J. Sm.]的干燥根莖[1]，為常用中藥，現(xiàn)已明確規(guī)定可以用于保健食品。骨碎補(bǔ)中的柚皮苷和新北美圣草苷含量較高，為骨碎補(bǔ)中的主要活性成分?，F(xiàn)代研究[2-5]表明柚皮苷作為骨碎補(bǔ)主要活性成分，在提高成骨細(xì)胞的增殖、分化方面起到主要作用。目前對(duì)于RDN(即骨碎補(bǔ)中的柚皮苷)的提取工藝尚未有系統(tǒng)化的研究，本文旨在采用超聲協(xié)同復(fù)合酶法，研究響應(yīng)面優(yōu)化RDN的提取工藝，酶解法能夠加速活性成分的溶解和釋放，超聲波產(chǎn)生的空化作用、機(jī)械作用、熱作用可以從整體上提高提取過程的傳質(zhì)速率和效果，從而可以大大提高RDN的提取量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

骨碎補(bǔ)，購(gòu)于藥店市售。柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)品(≥98%)，抗壞血酸(≥98%)，1,1-二苯基-2-苦肼基，水楊酸，F(xiàn)eSO4，鄰苯三酚，鐵氰化鉀，F(xiàn)eCl3等均為分析純。纖維素酶(1.4×106U/g)和果膠酶(1.0×105U/g)北京博奧拓達(dá)科技有限公司。

1.2 設(shè)備

YP2001N型電子天平，上海精天電子儀器廠；UV-5500PC紫外可見分光光度計(jì)， 上海元析儀器有限公司；722S可見分光光度計(jì)，上海精科儀器有限公司；KQ-300DE型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 原料處理

將骨碎補(bǔ)原料清洗干凈，低溫干燥至恒重后粉碎為60目粉末，在pH4.6的條件下以1∶1的比例加入纖維素酶和果膠酶共9mg/g于50℃水浴中酶解90min，得到骨碎補(bǔ)酶解液。

1.3.2 RDN的測(cè)定方法及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

RDN的測(cè)定方法參照Davis分光光度法[6]。以柚皮苷質(zhì)量濃度X(mg/L)為橫坐標(biāo)，吸光度值Y(A)為縱坐標(biāo)，繪制柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，并計(jì)算回歸方程。

1.3.3 RDN的提取過程及得率的計(jì)算

Y=(C×V×N)/M

式中：Y—柚皮苷提取量，mg/g；C-柚皮苷質(zhì)量濃度，mg/mL；V-溶液體積，mL；N-稀釋倍數(shù)；M-骨碎補(bǔ)干粉質(zhì)量，g。

1.3.4 單因素試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取骨碎補(bǔ)粉末2.00g，按1.3.1方法處理后，分別考察在以下不同的超聲時(shí)間(10、20、30、40、50min)、料液比(1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 )、乙醇濃度(40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%)、超聲溫度(40、50、60 、70、80℃)條件下提取RDN的得率。

1.3.5 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，運(yùn)用 Design-Expert 軟件，根據(jù) Box-Behnken 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理[7]，以超聲溫度、超聲時(shí)間、乙醇濃度、料液比作為自變量，以RDN的提取量為響應(yīng)值設(shè)計(jì)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案如表1。

表1 因素水平表

1.3.6 數(shù)據(jù)分析

采用 Excel、SPSS 20.0軟件和Origin 8.5.1對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析(顯著性界值為p<0.05，極顯著性界值為p<0.01)。

2 結(jié)果與分析

2.1 RDN的標(biāo)準(zhǔn)曲線

柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示，分析得到回歸方程為Y=0.0047X+0.009，相關(guān)系數(shù)R2=0.9981，結(jié)果表明，柚皮苷質(zhì)量濃度在0～200mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖1 RDN標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 超聲波提取RDN的單因素試驗(yàn)結(jié)果

圖2 超聲溫度對(duì)RDN提取量的影響

由圖2可知，RDN提取量隨著超聲溫度的升高先升后降，可能是由于提取溫度的升高加速了乙醇揮發(fā)而降低固液比所致。還可能是因?yàn)樵诮徇^程中高溫破壞了有效成分，從而導(dǎo)致溶解受阻，浸提量反而減小。

圖3 超聲時(shí)間對(duì)RDN提取量的影響

由圖3可知，RDN提取量隨著超聲時(shí)間的推進(jìn)呈先升后降的趨勢(shì)。這可能是由于細(xì)胞中有更多雜質(zhì)溶出，影響溶劑極性，導(dǎo)致RDN得率下降，而且與空氣接觸時(shí)間過長(zhǎng)，一部分RDN有可能已經(jīng)被分解。

圖4 乙醇濃度對(duì)RDN提取量的影響

由圖4可知，當(dāng)乙醇濃度<65%時(shí)，RDN提取量隨著乙醇濃度的增大呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)；在乙醇濃度為55%時(shí)，RDN提取量達(dá)到最大值，可能原因是RDN在濃度為55%的乙醇溶液中傳質(zhì)阻力較小，溶解度較大；在乙醇濃度為70%時(shí)，RDN二次增大，可能是因?yàn)榇藭r(shí)的溶劑極性很大，由于RDN具有一定的極性，根據(jù)相似相容原理，柚皮苷在此時(shí)的溶解性很大，從而導(dǎo)致RDN提取量較大。但高濃度的乙醇易于發(fā)揮從而造成乙醇的損失，降低固液比，也不利于RDN的提取。

圖5 料液比對(duì)RDN提取量的影響

由圖5可知，液料比由1∶5到1∶25時(shí)，隨著液料比的升高，RDN的提取量顯著增加，在料液比為1∶20的條件下經(jīng)過一個(gè)小幅度的減少后，在料液比達(dá)到1∶25時(shí)，RDN的提取量達(dá)到最大值。這說明液料比在1∶5到1∶25之間時(shí)，料液接觸不夠充分而且柚皮苷在乙醇溶劑中的溶解還沒有達(dá)到飽和，隨著溶劑的增多，料液接觸更充分，有效成分進(jìn)一步溶出。當(dāng)料液比增加到1∶25時(shí)，浸提量達(dá)到了最大值。繼續(xù)增加液料比時(shí)，提取量逐漸變小反而明顯下降，可能原因是隨著溶劑體積變大，RDN的浸提量已不再增加，使得提取液被稀釋。

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

表2 響應(yīng)面分析試驗(yàn)結(jié)果

響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果如表2，根據(jù)軟件獲得二次回歸數(shù)學(xué)模型為：

Y=15.20.11A+0.66B-0.51C-0.48D-0.46AB+0.038AC+0.081AD-0.11BC+8.669E-003BD+0.65CD-1.52A1.31B0.96C1.60D2

從圖6三維響應(yīng)圖中可以直觀地看出各因素之間的交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響。

由響應(yīng)面預(yù)測(cè)模型預(yù)測(cè)的最佳提取條件結(jié)合實(shí)際，響應(yīng)面預(yù)測(cè)的最優(yōu)條件為：先酶解，然后以1∶24的料液比，乙醇濃度55%，70℃，500W，超聲32min，此時(shí)RDN提取量15.07mg/g。

a.超聲溫度和超聲時(shí)間

b. 超聲溫度和乙醇濃度

c. 超聲溫度和液料比

d. 超聲時(shí)間和乙醇濃度

e. 乙醇濃度和酶解溫度

f. 液料比和乙醇濃度圖6 兩因素交互作用對(duì)RDN提取量的響應(yīng)面

3 結(jié)論

在提取RDN方面得到了可使RDN的提取量達(dá)到15.07mg/g的最佳工藝條件，與之前進(jìn)行的只用酶法提取或只用超聲波法提取相比均大幅提高了提取率，也較之相關(guān)報(bào)道的[8]研究方法，較大地提高了RDN的提取量，這可能是因?yàn)槊负统暡ǖ墓餐饔脤⒓?xì)胞壁破壞，使得胞內(nèi)物質(zhì)得以快速釋放進(jìn)而使得更多的柚皮苷被地檢測(cè)出來。雖然骨碎補(bǔ)被納入可用于保健品的名錄中，但目前對(duì)于骨碎補(bǔ)的開發(fā)與研究大多還是在醫(yī)藥方面[9-11]。本文系統(tǒng)完善地提供了RDN提取工藝要點(diǎn)，對(duì)骨碎補(bǔ)進(jìn)行研究,對(duì)于充分開發(fā)利用我國(guó)豐富的植物資源，促進(jìn)深加工相關(guān)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展進(jìn)而取得顯著的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益具有重要的意義。