張智，楊柳，尹文哲，高群

(1.東北林業(yè)大學，哈爾濱 150040；2. 哈爾濱醫(yī)科大學，哈爾濱 150086)

骨碎補是水龍骨科(Polypodiaceae)植物槲蕨 [Drynariafortunei(Kunze) J. Sm.]的干燥根莖[1]，為常用中藥，現已明確規(guī)定可以用于保健食品。骨碎補中的柚皮苷和新北美圣草苷含量較高，為骨碎補中的主要活性成分?，F代研究[2-5]表明柚皮苷作為骨碎補主要活性成分，在提高成骨細胞的增殖、分化方面起到主要作用。目前對于RDN(即骨碎補中的柚皮苷)的提取工藝尚未有系統(tǒng)化的研究，本文旨在采用超聲協(xié)同復合酶法，研究響應面優(yōu)化RDN的提取工藝，酶解法能夠加速活性成分的溶解和釋放，超聲波產生的空化作用、機械作用、熱作用可以從整體上提高提取過程的傳質速率和效果，從而可以大大提高RDN的提取量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

骨碎補，購于藥店市售。柚皮苷標準品(≥98%)，抗壞血酸(≥98%)，1,1-二苯基-2-苦肼基，水楊酸，FeSO4，鄰苯三酚，鐵氰化鉀，FeCl3等均為分析純。纖維素酶(1.4×106U/g)和果膠酶(1.0×105U/g)北京博奧拓達科技有限公司。

1.2 設備

YP2001N型電子天平，上海精天電子儀器廠；UV-5500PC紫外可見分光光度計， 上海元析儀器有限公司；722S可見分光光度計，上海精科儀器有限公司；KQ-300DE型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 原料處理

將骨碎補原料清洗干凈，低溫干燥至恒重后粉碎為60目粉末，在pH4.6的條件下以1∶1的比例加入纖維素酶和果膠酶共9mg/g于50℃水浴中酶解90min，得到骨碎補酶解液。

1.3.2 RDN的測定方法及標準曲線的繪制

RDN的測定方法參照Davis分光光度法[6]。以柚皮苷質量濃度X(mg/L)為橫坐標，吸光度值Y(A)為縱坐標，繪制柚皮苷標準曲線圖，并計算回歸方程。

1.3.3 RDN的提取過程及得率的計算

Y=(C×V×N)/M

式中：Y—柚皮苷提取量，mg/g；C-柚皮苷質量濃度，mg/mL；V-溶液體積，mL；N-稀釋倍數；M-骨碎補干粉質量，g。

1.3.4 單因素試驗

準確稱取骨碎補粉末2.00g，按1.3.1方法處理后，分別考察在以下不同的超聲時間(10、20、30、40、50min)、料液比(1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 )、乙醇濃度(40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%)、超聲溫度(40、50、60 、70、80℃)條件下提取RDN的得率。

1.3.5 響應面優(yōu)化試驗

在單因素試驗基礎上，運用 Design-Expert 軟件，根據 Box-Behnken 中心組合試驗設計原理[7]，以超聲溫度、超聲時間、乙醇濃度、料液比作為自變量，以RDN的提取量為響應值設計響應面優(yōu)化試驗，設計試驗方案如表1。

表1 因素水平表

1.3.6 數據分析

采用 Excel、SPSS 20.0軟件和Origin 8.5.1對數據進行分析(顯著性界值為p<0.05，極顯著性界值為p<0.01)。

2 結果與分析

2.1 RDN的標準曲線

柚皮苷標準曲線如圖1所示，分析得到回歸方程為Y=0.0047X+0.009，相關系數R2=0.9981，結果表明，柚皮苷質量濃度在0～200mg/L范圍內線性關系良好。

圖1 RDN標準曲線

2.2 超聲波提取RDN的單因素試驗結果

圖2 超聲溫度對RDN提取量的影響

由圖2可知，RDN提取量隨著超聲溫度的升高先升后降，可能是由于提取溫度的升高加速了乙醇揮發(fā)而降低固液比所致。還可能是因為在浸提過程中高溫破壞了有效成分，從而導致溶解受阻，浸提量反而減小。

圖3 超聲時間對RDN提取量的影響

由圖3可知，RDN提取量隨著超聲時間的推進呈先升后降的趨勢。這可能是由于細胞中有更多雜質溶出，影響溶劑極性，導致RDN得率下降，而且與空氣接觸時間過長，一部分RDN有可能已經被分解。

圖4 乙醇濃度對RDN提取量的影響

由圖4可知，當乙醇濃度<65%時，RDN提取量隨著乙醇濃度的增大呈現先上升后下降的趨勢；在乙醇濃度為55%時，RDN提取量達到最大值，可能原因是RDN在濃度為55%的乙醇溶液中傳質阻力較小，溶解度較大；在乙醇濃度為70%時，RDN二次增大，可能是因為此時的溶劑極性很大，由于RDN具有一定的極性，根據相似相容原理，柚皮苷在此時的溶解性很大，從而導致RDN提取量較大。但高濃度的乙醇易于發(fā)揮從而造成乙醇的損失，降低固液比，也不利于RDN的提取。

圖5 料液比對RDN提取量的影響

由圖5可知，液料比由1∶5到1∶25時，隨著液料比的升高，RDN的提取量顯著增加，在料液比為1∶20的條件下經過一個小幅度的減少后，在料液比達到1∶25時，RDN的提取量達到最大值。這說明液料比在1∶5到1∶25之間時，料液接觸不夠充分而且柚皮苷在乙醇溶劑中的溶解還沒有達到飽和，隨著溶劑的增多，料液接觸更充分，有效成分進一步溶出。當料液比增加到1∶25時，浸提量達到了最大值。繼續(xù)增加液料比時，提取量逐漸變小反而明顯下降，可能原因是隨著溶劑體積變大，RDN的浸提量已不再增加，使得提取液被稀釋。

2.3 響應面優(yōu)化試驗結果

表2 響應面分析試驗結果

響應面優(yōu)化試驗結果如表2，根據軟件獲得二次回歸數學模型為：

Y=15.20.11A+0.66B-0.51C-0.48D-0.46AB+0.038AC+0.081AD-0.11BC+8.669E-003BD+0.65CD-1.52A1.31B0.96C1.60D2

從圖6三維響應圖中可以直觀地看出各因素之間的交互作用對響應值的影響。

由響應面預測模型預測的最佳提取條件結合實際，響應面預測的最優(yōu)條件為：先酶解，然后以1∶24的料液比，乙醇濃度55%，70℃，500W，超聲32min，此時RDN提取量15.07mg/g。

a.超聲溫度和超聲時間

b. 超聲溫度和乙醇濃度

c. 超聲溫度和液料比

d. 超聲時間和乙醇濃度

e. 乙醇濃度和酶解溫度

f. 液料比和乙醇濃度圖6 兩因素交互作用對RDN提取量的響應面

3 結論

在提取RDN方面得到了可使RDN的提取量達到15.07mg/g的最佳工藝條件，與之前進行的只用酶法提取或只用超聲波法提取相比均大幅提高了提取率，也較之相關報道的[8]研究方法，較大地提高了RDN的提取量，這可能是因為酶和超聲波的共同作用將細胞壁破壞，使得胞內物質得以快速釋放進而使得更多的柚皮苷被地檢測出來。雖然骨碎補被納入可用于保健品的名錄中，但目前對于骨碎補的開發(fā)與研究大多還是在醫(yī)藥方面[9-11]。本文系統(tǒng)完善地提供了RDN提取工藝要點，對骨碎補進行研究,對于充分開發(fā)利用我國豐富的植物資源，促進深加工相關產業(yè)的發(fā)展進而取得顯著的經濟效益和社會效益具有重要的意義。