王步云，喬 巖，張 濤，鄭書(shū)恒，趙 磊，萬(wàn) 敏，李恒羽，王吐虹

(1.北京市植物保護(hù)站，北京 100029； 2.CABI東亞中心，北京 100081；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，北京 100193)

草莓炭疽病是全世界草莓產(chǎn)區(qū)的重要病害，在草莓整個(gè)生育期都可以發(fā)生危害[1]。近年來(lái)，因復(fù)種年限延長(zhǎng)、種植品種單一、感病品種種植面積擴(kuò)大，炭疽病病原積累增多，加之設(shè)施密閉及高溫高濕環(huán)境，導(dǎo)致草莓炭疽病已上升為草莓苗期的主要病害[2-3]，尤其是在草莓連作地，給草莓生產(chǎn)帶來(lái)了嚴(yán)重障礙，可造成草莓減產(chǎn)25%～30%，嚴(yán)重時(shí)甚至可造成整棚死苗，極大地影響草莓的產(chǎn)量和品質(zhì)[4-5]。

國(guó)外關(guān)于草莓炭疽病病原菌的報(bào)道有很多。MASS[6]的研究認(rèn)為，草莓炭疽病由尖孢炭疽菌(Colletotrichumacutatum)、膠孢炭疽菌(C.gloeosporioides)、黑線(xiàn)炭疽菌(C.dematium)和草莓炭疽菌(C.fragariae)等4種病原菌引起，但是目前被普遍認(rèn)可的是，C.acutatum、C.gloeosporioides、C.fragariae等3種病原菌可引起草莓炭疽病[7]。我國(guó)關(guān)于草莓炭疽病病原菌的研究相對(duì)較少。任小杰等[8]的研究表明，上海市草莓炭疽病病原菌的主要種類(lèi)是C.acutatum和C.gloeosporioides。萬(wàn)瑤[9]通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，上海、浙江建德和浙江杭州草莓主要產(chǎn)區(qū)的草莓炭疽病病原菌主要為C.acutatum、C.gloeosporioides和C.fragariae。張海英等[10]的研究表明，遼寧撫順市草莓炭疽病的病原菌主要是C.gloeosporioides。楊敬輝等[11]對(duì)江蘇句容的草莓炭疽病樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，病原為圍小叢殼菌(Glmoerellacingulata)。

由于草莓果實(shí)屬漿果，是鮮食水果，果實(shí)一般直接入口，因此對(duì)農(nóng)藥殘留要求嚴(yán)格。目前生產(chǎn)上主要使用多菌靈、苯醚甲酰胺等化學(xué)農(nóng)藥防治草莓炭疽病，但由于多年連續(xù)使用，導(dǎo)致病菌對(duì)一些藥劑產(chǎn)生抗性，不僅防治效果不夠理想，且易造成農(nóng)藥殘留[4]。因此，篩選高效、安全的生物藥劑并提供合理安全的用藥技術(shù)，不僅可以對(duì)草莓種植戶(hù)在采摘期的用藥進(jìn)行科學(xué)有效指導(dǎo)，而且可以有效保障草莓生產(chǎn)和食用安全。

本研究通過(guò)采集北京多個(gè)草莓種植區(qū)的草莓炭疽病樣本，對(duì)病原菌進(jìn)行分離、鏡檢、純化培養(yǎng)及形態(tài)學(xué)觀(guān)察，初步明確北京地區(qū)草莓炭疽病病原菌的主要類(lèi)型；同時(shí)，為了篩選防治草莓炭疽病的高效藥劑，選擇5種不同的生物藥劑進(jìn)行田間藥效試驗(yàn)，以期為草莓炭疽病的防治提供參考和依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試材料

供試作物：草莓品種為紅顏。

供試培養(yǎng)基：PD、PDA、PSA培養(yǎng)基配方參考方中達(dá)《植病研究方法》[12]。

供試藥劑：所用生物藥劑5種，見(jiàn)表1。

表1 供試藥劑及使用劑量

主要設(shè)備：WS-16手動(dòng)噴霧器購(gòu)自山東衛(wèi)士植保機(jī)械有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 草莓炭疽病病原鑒定

1.2.1.1 樣本采集 2017年4月—2018年3月，選擇北京草莓產(chǎn)區(qū)昌平區(qū)興壽鎮(zhèn)、崔村鎮(zhèn)，平谷區(qū)山東村鎮(zhèn)、馬坊鎮(zhèn)，大興區(qū)黃村鎮(zhèn)、龐各莊鎮(zhèn)的草莓種植基地，于定植期和開(kāi)花結(jié)果期2個(gè)時(shí)間段采集草莓炭疽病的發(fā)病植株，每個(gè)鎮(zhèn)20個(gè)樣本，共抽取樣本120個(gè)，對(duì)葉片、葉柄和匍匐莖采用常規(guī)病組織分離方法分離病原菌。

1.2.1.2 病原菌分離與純化 在病健交界處切取適當(dāng)大小的組織塊，在75%乙醇中浸泡30 s～1 min或0.1%升汞中浸泡3～5 min進(jìn)行消毒，用無(wú)菌水漂洗3次，接種在PDA培養(yǎng)基上，置于25 ℃黑暗條件下培養(yǎng)2 d，挑取菌落邊緣菌絲，轉(zhuǎn)至PDA平板上進(jìn)行純化，經(jīng)顯微形態(tài)鑒定后，轉(zhuǎn)至PDA試管斜面4 ℃保存。

1.2.1.3 病原菌形態(tài)學(xué)觀(guān)察 將病原菌接種在PDA培養(yǎng)基上于25 ℃恒溫黑暗培養(yǎng)，觀(guān)察菌落特征，詳細(xì)記錄菌落的形態(tài)、顏色、直徑等，并且隨機(jī)測(cè)定100個(gè)分生孢子大小。在PSA培養(yǎng)基上25 ℃培養(yǎng)3～4周后，觀(guān)察是否有有性態(tài)的產(chǎn)生。將病原菌的分生孢子形態(tài)和大小以及有性態(tài)的有無(wú)作為形態(tài)鑒定的依據(jù)，通過(guò)查閱相關(guān)文獻(xiàn)[13-14]，確定病原菌的分類(lèi)地位，并根據(jù)病原菌的培養(yǎng)性狀和顯微形態(tài)特征，統(tǒng)計(jì)分離得到的病原菌種類(lèi)和比例，確定優(yōu)勢(shì)菌群。

1.2.1.4 病原菌致病性測(cè)定 采用傷根接種法對(duì)分離得到的病原菌進(jìn)行致病性測(cè)定。

(1)接種體準(zhǔn)備：將供試菌株在PD液體培養(yǎng)基中28 ℃振蕩培養(yǎng)5 d，4層無(wú)菌紗布過(guò)濾后，打碎菌絲體，加適當(dāng)無(wú)菌水稀釋成菌絲體懸浮液。

(2)接種：接種前適時(shí)澆水保持營(yíng)養(yǎng)缽內(nèi)基質(zhì)濕潤(rùn)，用玻璃棒在距草莓幼苗根莖約2 cm處扎一孔，再用滅菌刀片在草莓須根部造成傷口若干，將25 mL的接種體懸浮液灌入孔內(nèi)，設(shè)3次重復(fù)，每次重復(fù)5株，即每個(gè)菌株共接種15株草莓幼苗。設(shè)傷根不接種為空白對(duì)照。保濕48 h后將植株轉(zhuǎn)入光照強(qiáng)度5 000 lx、25～30 ℃的溫室培養(yǎng)。

(3)病情調(diào)查：接種14 d后根據(jù)草莓炭疽病分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行病害調(diào)查，并根據(jù)柯赫氏法則，對(duì)發(fā)病植株進(jìn)行病原菌重新分離，顯微觀(guān)察得到的病菌是否與原接種菌株相同。

草莓炭疽病分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：0級(jí)，無(wú)病癥；1級(jí)，發(fā)病部出現(xiàn)淺紅色和褪色暈圈，或紅褐色斑點(diǎn)，病斑平均長(zhǎng)度≤2.0 mm，葉片邊緣有少量紅褐色病斑；3級(jí)，病斑沿葉柄或匍匐莖方向向兩側(cè)擴(kuò)大呈梭形黑褐色凹陷病痕，病斑平均長(zhǎng)度在2.1～5.0 mm；5級(jí)，出現(xiàn)典型的紡錘形病斑，病斑平均長(zhǎng)度在5.1～9.0 mm；7級(jí)，病斑擴(kuò)大，平均長(zhǎng)度為9.1～15.0 mm；9級(jí)，葉柄或匍匐莖發(fā)病部呈黑色抽縮狀，發(fā)病葉柄的葉片伴隨出現(xiàn)萎蔫，病斑平均長(zhǎng)度>15.0 mm。

1.2.2 防治草莓炭疽病生物藥劑篩選

1.2.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)于2018年10月19日—11月2日在順義區(qū)南法信鎮(zhèn)衙門(mén)村的北京市植物保護(hù)站新技術(shù)試驗(yàn)示范基地草莓溫室進(jìn)行。溫室大棚中草莓長(zhǎng)勢(shì)均勻，處于育苗期，炭疽病零星發(fā)生，肥水管理一致。試驗(yàn)設(shè)7個(gè)處理(表1)，每個(gè)處理重復(fù)3次，采用隨機(jī)區(qū)組排列，每個(gè)小區(qū)長(zhǎng)7 m、寬3 m，小區(qū)面積為21 m2。

1.2.2.2 施藥時(shí)間及方法 施藥時(shí)間：2018年 10月19日施藥1次。

施藥方法：按藥劑使用說(shuō)明書(shū)推薦劑量進(jìn)行噴施，使用噴霧器均勻噴施藥劑于植株各部，空白對(duì)照區(qū)噴施等量清水。

1.2.2.3 調(diào)查方法 每小區(qū)對(duì)角線(xiàn)5點(diǎn)取樣，每點(diǎn)調(diào)查5株共25株，分別于施藥前，施藥后7、14 d調(diào)查植株發(fā)病情況，根據(jù)1.2.1.4中的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)記錄不同處理的病株病級(jí)，計(jì)算病情指數(shù)和防治效果。

病情指數(shù)=Σ(各級(jí)病株數(shù)×相對(duì)級(jí)數(shù)值)/(調(diào)查總株數(shù)×最高病級(jí)值)×100，防治效果=[1-(CK0×PT1)/(CK1×PT0)] ×100%。

式中，CK0表示空白對(duì)照區(qū)施藥前病情指數(shù)，CK1表示空白對(duì)照區(qū)施藥后病情指數(shù)，PT0表示藥劑處理區(qū)施藥前病情指數(shù)，PT1表示藥劑處理區(qū)施藥后病情指數(shù)。

數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行分析，差異顯著性分析采用Duncan’s新復(fù)極差法(SSR法)。

2 結(jié)果與分析

2.1 草莓炭疽病病原鑒定結(jié)果

從120個(gè)樣本上共計(jì)分離到136個(gè)菌株，在PDA上培養(yǎng)的菌落早期均為白色，3～4 d后菌落可以分為2種類(lèi)型：一種表現(xiàn)為菌落中間灰色(灰黑、青灰色或者灰白色)，邊緣新生的菌絲為白色地毯狀，氣生菌絲較少(圖1A)，可產(chǎn)生無(wú)色、單胞、棍棒形的分生孢子，單孢大小為 (3.0～5.9)μm×(11.7～21.1)μm(圖1C)，多數(shù)菌株可以產(chǎn)生有性階段的子囊殼，棍棒狀的子囊中有8個(gè)腎形子囊孢子，子囊孢子無(wú)色、單胞、橢圓形、略彎；另一種表現(xiàn)為菌落中間粉紅色棉絮狀，邊緣新生菌絲白色，氣生菌絲較多(圖1B、1D)，產(chǎn)生的分生孢子無(wú)色、單胞、梭形，在PSA上不能產(chǎn)生有性階段。

A: 膠孢炭疽菌菌落形態(tài)；B: 尖孢炭疽菌菌落形態(tài)；

通過(guò)對(duì)菌落形態(tài)和顯微性狀觀(guān)察(圖1)，按BOOTH[13]和余永年[14]的分類(lèi)系統(tǒng)最終將其中119個(gè)菌株鑒定為膠孢炭疽菌(C.gloeosporioides)，占總分離菌株數(shù)的87.5%，將17個(gè)菌株鑒定為尖孢炭疽菌(C.acutatum)，占總分離菌株數(shù)的12.5%，初步明確引起京郊地區(qū)草莓炭疽病的病原優(yōu)勢(shì)菌為膠孢炭疽菌。

將分離得到的136個(gè)菌株接種到草莓幼苗上，其中有54株膠孢炭疽菌和9株尖孢炭疽菌對(duì)草莓幼苗有不同程度的致病力，其他分離得到的菌株均無(wú)致病力。結(jié)果再次表明，膠孢炭疽菌為京郊地區(qū)草莓炭疽病的致病優(yōu)勢(shì)菌種。

2.2 防治草莓炭疽病生物藥劑篩選結(jié)果

由表2可知，在藥后7 d，供試藥劑對(duì)草莓炭疽病的防效從大到小依次為0.5%大黃素甲醚水劑(74.7%)、2%綠寶水劑(72.7%)、45%咪鮮胺水乳劑(71.2%)、1%蛇床子素微乳劑(64.3%)、1 000億個(gè)/g枯草芽孢桿菌可濕性粉劑(62.1%)、5%氨基寡糖素水劑(60.1%)，各藥劑防效之間沒(méi)有顯著差異；藥后14 d，2%綠寶水劑、0.5%大黃素甲醚水劑防效均在65%以上，分別為67.4%、65.7%，與對(duì)照藥劑(45%咪鮮胺水乳劑)的防效(64.2%)沒(méi)有顯著差異，其他藥劑防效均在50%以下，與對(duì)照藥劑有顯著差異。因此，2%綠寶水劑、0.5%大黃素甲醚水劑防治草莓炭疽病的速效性和持效性都很好。

表2 生物藥劑對(duì)草莓炭疽病的防治效果

注：同列數(shù)據(jù)后不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note:Different lowercase letters after the data in the same column indicate that the difference reaches a significant level(P<0.05).

3 結(jié)論與討論

3.1 草莓炭疽病的病原鑒定

目前，國(guó)內(nèi)外報(bào)道的草莓炭疽病病原菌主要有C.fragariae、C.gloeosporioides和C.acutatum3種[8,15]，而關(guān)于這3種病菌在我國(guó)具體的發(fā)生與分布還沒(méi)有系統(tǒng)研究。本研究通過(guò)在北京市昌平區(qū)、平谷區(qū)和大興區(qū)進(jìn)行采樣調(diào)查，并進(jìn)行病原菌鑒定，最終確定引起這3個(gè)地區(qū)草莓炭疽病的病原菌為C.gloeosporioides和C.acutatum，而且C.gloeosporioides為優(yōu)勢(shì)菌群。

本試驗(yàn)針對(duì)北京部分草莓主產(chǎn)區(qū)草莓炭疽病病原菌種類(lèi)進(jìn)行研究，具有一定的代表性，但是沒(méi)有對(duì)其他地區(qū)草莓生產(chǎn)區(qū)的病原菌種類(lèi)進(jìn)行鑒定，另外也沒(méi)有進(jìn)行分子生物學(xué)方面的鑒定，需在后期工作中繼續(xù)開(kāi)展研究。

3.2 防治草莓炭疽病生物藥劑的篩選

本研究對(duì)防治草莓炭疽病的5種生物藥劑進(jìn)行篩選，結(jié)果表明，2%綠寶水劑、0.5%大黃素甲醚水劑在藥后7、14 d防效均在65%以上，且與對(duì)照藥劑45%咪鮮胺水乳劑的防效沒(méi)有顯著差異，其他藥劑在藥后14 d防效均在50%以下，與45%咪鮮胺水乳劑有顯著差異。因此，2%綠寶水劑、0.5%大黃素甲醚水劑對(duì)草莓炭疽病防治的速效性和持效性均較好。

生物農(nóng)藥作為綠色、有機(jī)農(nóng)產(chǎn)品最主要的投入品之一，因其選擇性強(qiáng)、對(duì)有害生物高效、對(duì)人畜安全、對(duì)環(huán)境友好、不易產(chǎn)生抗藥性、生產(chǎn)原料廣泛[16-17]等特點(diǎn)，在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有越來(lái)越重要的地位。目前生物農(nóng)藥的防效日益提高，很多生物農(nóng)藥的防效已與化學(xué)農(nóng)藥相當(dāng)[18-20]，甚至優(yōu)于化學(xué)農(nóng)藥[21-22]。迮?；莸萚18]通過(guò)田間試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，1%蛇床子素水乳劑對(duì)草莓白粉病的防效與4%朵麥可水乳劑的防效相當(dāng)。王美林等[20]的研究發(fā)現(xiàn)，1 000億個(gè)/g枯草芽孢桿菌對(duì)草莓炭疽病的防治效果與25%多菌靈可濕性粉劑、450 g/L咪鮮胺水乳劑的防效相當(dāng)。由本試驗(yàn)研究結(jié)果可知，2%綠寶水劑和0.5%大黃素甲醚水劑的防效與45%咪鮮胺水乳劑沒(méi)有顯著差異，因此，在草莓炭疽病的防治中，2%綠寶水劑和0.5%大黃素甲醚水劑可以替代化學(xué)農(nóng)藥，建議在生產(chǎn)中推廣使用，從而有效提高草莓生產(chǎn)和食用安全。