歐浩，李國玲，王豪強，黃廣燕，蔡更元,2，李紫聰，吳珍芳,2，張獻偉,2

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MEK抑制劑PD0325901顯著提高豬胎兒成纖維細胞ssODN介導的HDR效率

歐浩1，李國玲1，王豪強1，黃廣燕1，蔡更元1,2，李紫聰1，吳珍芳1,2，張獻偉1,2

1. 華南農業(yè)大學動物科學學院，國家生豬種業(yè)工程技術研究中心，廣州 510642 2. 溫氏食品集團股份有限公司，新興 527400

基因組DNA發(fā)生雙鏈斷裂(double strand break, DSB)后主要通過同源定向修復(homologous-directed repair, HDR)和非同源末端連接(nonhomologous end joining, NHEJ)兩種途徑進行修復，其中單鏈寡聚核苷酸(single-stranded oligodeoxyribonucleotide, ssODN)介導的同源定向修復是動物基因組常用的基因組定點修飾技術，具有較大的科研和應用價值。為提高豬基因組ssODN介導HDR效率，本研究以豬胎兒成纖維細胞(porcine fetal fibroblasts, PFFs)為研究對象，利用絲裂原活化的細胞外信號調節(jié)激酶(mitogen-activated extracellular signal-regulated kinase, MEK)抑制劑PD0325901培養(yǎng)細胞，研究其對HDR效率的影響及作用分子機理。結果顯示，PD0325901能顯著提高PFFs的G2期和S期細胞群百分比，減少G1期細胞群比率，促進HDR修復因子的表達。在最適濃度250 nmol/L時，PD0325901使ssODN介導的GFP報告載體的修復效率提高了58.8%；同時使PFFs基因組位點和定點修飾效率分別提高了48.16%和17.64%。本研究表明，MEK抑制劑PD0325901能顯著提高豬基因組ssODN介導的同源定向修復效率，為高效制備定點基因修飾動物模型提供了新思路。

MEK抑制劑；同源定向修復(HDR)；PD0325901；基因編輯

傳統(tǒng)轉基因技術是將目的基因隨機整合到基因組中并使之表達，無法控制轉基因的整合位點，且伴隨著效率低、表達穩(wěn)定性差等問題，為轉基因動物品系和育種品系的建立帶來諸多不便。隨著鋅指核酸內切酶(zinc-finger endonuclease, ZFN)[1]、類轉錄激活因子效應物核酸酶(transcription activator-like effector nuclease, TALEN)[2]、規(guī)律成簇的間隔短回文重復(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)[3]，以及結構引導的核酸酶(structure- guided nuclease, SGN)[4]等新型基因編輯技術的出現，使動物基因組DNA突變的效率和準確性大大提高，推動了基因定向修飾動物的研究[5]。新型基因編輯技術可在基因組內高效產生雙鏈斷裂(double strand break, DSB)，激活細胞中兩種DNA修復路徑——同源重組定向修復(homologous-directed repair, HDR)和非同源末端連接(nonhomologous end joining, NHEJ)。NHEJ無需同源修復模板，由NHEJ修復因子將DNA雙鏈斷裂的兩端強行拼接起來，容易造成基因片段的缺失、突變或外源基因的插入等，是基因敲除的有效途徑；HDR路徑需要同源DNA模板，修復過程產生錯誤的概率較低，是定向突變和定點敲入(knock-in, KI)最為依賴的修復路徑[6]。盡管運用新型基因編輯工具能夠使細胞DNA發(fā)生DSB的效率和準確性極大的提高，但雙鏈DNA模板修復效率相對較低，只有0.5%~20%左右，利用HDR進行高效的定點敲入具有較大的難度[3,7]。相比雙鏈DNA模板，單鏈寡聚核苷酸(single-stranded oligodeoxyribonucleotide, ssODN)作為同源修復模板具有更高的定向修復效率[8~10]。目前，ssODN介導的DNA修復的具體通路仍然不是很清楚，但該途徑也需要在DSB的斷裂末端進行DNA末端剪切(DNA resection)，因此與其他HDR通路具有相同的起始途徑[11]。一般認為ssODN介導的同源定向修復途徑也屬于HDR的一種，有研究表明通過小分子化合物調控HDR通路，可以促進ssODN介導的定向修復效率。Maruyama等[12]使用小分子化合物Scr7(DNA連接酶Ⅳ抑制劑)將ssODN介導的定點整合效率提高了19倍；將Scr7直接注射至小鼠受精卵，使定點整合效率提高2倍。Ma等[13]使用VE-822 (Rad3相關激酶抑制劑)和AZD-7762 (檢查點激酶CHEK1的特異性抑制劑)將ssODN介導的定點整合效率提高3倍。雖然這些小分子化合物可顯著提高HDR效率[14]，但都主要集中在對人和小鼠的研究，對豬的研究鮮有報道[15,16]。由于大部分小分子化合物對細胞和胚胎存在一定的毒害作用，劑量過大會損傷細胞或基因編輯胚[17]，因此小分子化合物的使用劑量和新化合物的開發(fā)還需要繼續(xù)優(yōu)化。

RAS-RAF-MEK-ERK信號通路是調節(jié)細胞增殖、分化、代謝、凋亡和細胞周期等眾多細胞生理過程的主干信號通路，絲裂原活化的細胞外信號調節(jié)激酶(mitogen-activated extracellular signal-regulated kinase, MEK)是該信號通路的重要組成部分[18]。PD0325901是一種選擇性的非ATP競爭性MEK抑制劑，其與MEK結合會使MEK與ATP結合位點的構象發(fā)生變化，從而抑制MEK的激活[19,20]。Lin等[21]研究顯示，使用PD0325901和CHIR99021 (GSK3β抑制劑)能消除ESC (embryonic stem cell)細胞系之間同源重組效率的差異，表明MEK信號通路可能參與細胞DNA的同源重組修復，但該信號通路是否參與體細胞同源重組目前還沒有研究報道。

豬的生理學、解剖學和遺傳學特征與人類非常相似，是研究人類疾病的重要動物模型。杜氏肌營養(yǎng)不良癥(Duchenne muscular dystrophy, DMD)是一種X連鎖隱性遺傳病，由基因突變導致的人類肌肉萎縮無力，喪失獨立行走能力為特點的疾病，提高豬該位點的定點編輯效率對制備人類DMD疾病豬模型具有重要意義[22]。此外，基因位點是豬基因組上最常用的安全港位點，外源性的基因定點插入該位點能高效穩(wěn)定表達，同時不會影響其他內源基因的表達，因此常用該位點來構建基因編輯豬模型[23]。本研究以豬胎兒成纖維細胞(porcine fetal fibroblasts, PFFs)為研究對象，以和位點為靶點，利用MEK抑制劑PD0325901提高PFFs細胞中ssODN介導定向修復效率，為高效制備基因定向編輯豬模型提供重要參考信息。

1 材料與方法

1.1 材料

報告載體ssODN-mediated HDR reporter由本實驗室前期構建[24]。該報告載體中(enhanced green fluorescent protein)序列中間插入一個終止密碼子和一個HⅠ限制性內切酶位點，HⅠ用于線性化報告載體；該報告載體能與基因相應的同源模板重組，使表達綠色熒光信號，而沒有發(fā)生同源定向修復的則被提前終止翻譯。Cas9/sgRNA共表達質粒pX330 (Plasmid #42230)購自美國Addgene公司；PFFs細胞由溫氏食品集團股份有限公司提供；MEK抑制劑PD0325901購自美國Selleck公司；引物和ssODN由深圳華大基因科技有限公司合成。

1.2 Cas9/sgRNA共表達質粒的構建

在CCtop CRISPR/Cas9網站(https://crispr.cos. uni-heidelberg.de/index.html)設計和基因的sgRNA[25,26]，序列見表1。sgRNA引物混勻后置于95℃水中自然冷卻至室溫，使其形成雙鏈DNA，克隆到pX330-U6-hSpCas9質粒的Ⅰ位點上。

1.3 PD0325901配制及細胞培養(yǎng)

取適量PD0325901溶解于DMSO溶劑，添加至完全培養(yǎng)基(DMEM細胞培養(yǎng)基+10%胎牛血清)分別配置成25 nmol/L、50 nmol/L、100 nmol/L和250 nmol/L的溶液備用，復蘇后的PFF細胞培養(yǎng)至匯合度90% (10 cm板)，進行后續(xù)實驗。

表1 sgRNA序列信息

1.4 MTT法檢測細胞活性

復蘇后的PFF細胞培養(yǎng)至匯合度90% (10 cm板)，用0.25%胰酶消化，調整細胞密度為103~105個/孔至96孔板，加入100 μL/孔不同濃度梯度的培養(yǎng)基溶液，每個梯度設置8個重復，培養(yǎng)48 h。加20 μL/孔MTT溶液(5 mg/mL，即0.5%MTT)，培養(yǎng)4 h后去掉孔內培養(yǎng)液，加150 μL/孔二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀490 nm處測量各孔的吸光值，對結果進行統(tǒng)計分析。

1.5 流式細胞術檢測細胞周期

復蘇后的PFF細胞培養(yǎng)至匯合度90% (10 cm板)，用0.25%胰酶消化，鋪至6孔板，加入2 mL/孔不同濃度梯度的培養(yǎng)基溶液，每個梯度設置3個重復，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。消化細胞至1.5 mL離心管并去掉培養(yǎng)基，每管加500 μL預冷的70%乙醇(?20℃)，重懸，置于4℃固定過夜。隔天每管加500 μL碘化丙啶(propidium iodide, PI)染色液，充分振蕩，4℃避光孵育30 min，使用流式細胞儀進行檢測，利用軟件Modifit 5.0進行統(tǒng)計分析。

1.6 HDR和NHEJ相關基因表達水平的檢測

復蘇后的PFF細胞培養(yǎng)至匯合度90% (10 cm板)，用0.25%胰酶消化，鋪至6孔板，加入2 mL/孔不同濃度梯度的培養(yǎng)基溶液，每個梯度設置3個重復，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。使用RNA抽提試劑盒抽提總RNA，反轉錄后對cDNA進行實時熒光定量PCR檢測，分析NHEJ相關基因和HDR相關基因的表達水平。qRT-PCR反應條件：95℃預變性5 min；95℃變性15 s，60℃復性15 s，72℃延伸15 s，40個循環(huán)；溶解曲線95℃ 30 s；60℃ 30 s；95℃ 30 s。qRT-PCR引物見表2。

1.7 ssODN介導的HDR效率檢測

復蘇后的PFF細胞培養(yǎng)至匯合度90% (10 cm板)，用0.25%胰酶消化。參考美國Thermo fisher公司的Lipofectamine? LTX & Plus Reagent protocol說明書，共轉染8 μg/孔線性化的ssODN-mediate HDR reporter (HⅠ酶切)和1 μg/孔ssODN (序列見表3)，每個處理設置3個重復。鋪至6孔板培養(yǎng)24 h，加入2 mL/孔不同濃度梯度的培養(yǎng)基溶液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，使用流式細胞術檢測細胞熒光數的百分比。

表2 qRT-PCR引物序列信息

復蘇后的PFF細胞培養(yǎng)至匯合度90% (10 cm板)，用0.25%胰酶消化，分別共轉染8 μg/孔pX330--Cas9質粒和1 μg/孔ssODN、8 μg/孔pX330--Cas9質粒和1 μg/孔ssODN(序列見表3)，每個處理設置3個重復。鋪至6孔板培養(yǎng)24 h，加入2 mL/孔不同濃度梯度的培養(yǎng)基溶液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。抽提細胞總DNA，PCR擴增目的基因序列(引物序列見表 4)?；厥占兓蠓謩e使用T7 EndoⅠ和dⅢ酶切，進行瓊脂糖凝膠電泳分離，灰度掃描電泳條帶，根據公式：同源定向修復效率=dⅢ條帶灰度值/T7 EndoⅠ條帶灰度值，計算同源定向修復效率。同時按照中美泰和生物技術有限公司clone smarter TA克隆試劑盒(產品編號C5853)說明書，對純化的DNA進行TA克隆測序，計算同源定向修復效率。

表3 ssODN序列信息

表4 PCR引物序列

1.8 數據分析

采用 SPSS21 軟件進行獨立樣品-test分析，分析每個處理組與對照組的差異，數據以 Mean ± SEM表示。*<0.05表示差異顯著，**<0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 PD0325901對PFFs細胞活性和細胞周期分布的影響

PFF細胞經25 nmol/L、50 nmol/L、100 nmol/L和250 nmol/L濃度的PD0325901處理，使用MTT方法檢測細胞增殖活性。結果顯示，25 nmol/L、50 nmol/L、100 nmol/L濃度下細胞活性比對照組分別提高了17.2%、5%、10.12%，經250 nmol/L PD0325901處理后，細胞活性比對照組下降了6.35%。低濃度(25 nmol/L)對細胞活性有促進作用，而高濃度(250 nmol/L)對細胞活性具有一定的抑制作用，但差異不顯著(>0.05)，表明這4個濃度梯度的PD0325901對細胞活性沒有影響(圖1A)。流式細胞術檢測細胞結果顯示，隨著PD0325901濃度增加，處于G2期和S期的PFFs細胞群顯著增加(<0.05)，處于G1期細胞群顯著減少(<0.05) (圖1B)，細胞表現一定程度的同步化。

2.2 PD0325901對DNA修復因子表達水平的影響

PFFs細胞經不同濃度的PD0325901處理后，進行qRT-PCR檢測。結果顯示，NHEJ相關修復基因(和)和HDR相關修復基因(、、和)表達量隨PD0325901添加劑量的升高呈現不規(guī)律變化(圖2)。在NHEJ通路中，25 nmol/L和250 nmol/L PD0325901對和表達具有上調作用；但對于基因表達，僅250 nmol/L劑量對其具有上調作用。在HDR通路中，不同濃度PD0325901對和表達都有上調作用，在250 nmol/L劑量下，和基因表達量提高近3倍(0.05)，但二者表達量與PD0325901添加量不存在劑量依賴效應；然而對于和基因，100 nmol/L PD0325901對二者的表達呈現下調作用(<0.05)，而經其他劑量處理后，和基因的表達量均表現不同程度的上調作用。

圖1 PD0325901對細胞活性和細胞周期的影響

A：不同濃度的PD0325901對細胞活性的影響；B：不同濃度的PD0325901對細胞周期的影響。*<0.05，表示差異顯著。

圖2 PD0325901對DNA修復因子表達水平的影響

和為NHEJ相關修復基因；和為HDR相關修復基因。

*<0.05，表示差異顯著，**<0.01表示差異極顯著。

2.3 PD0325901對ssODN介導的HDR效率的影響

ssODN介導的HDR報告載體和相應ssODN共轉染至PFF細胞，流式細胞術結果顯示，25 nmol/L、50 nmol/L、100 nmol/L和250 nmol/L濃度PD0325901均能提高HDR效率，提高了32.3%~58.8% (0.05) (圖3，A~C)。X330--Cas9質粒和相應的ssODN共轉染至PFF細胞后，用dⅢ酶切方法評估基因位點編輯效率。結果顯示，25 nmol/L、50 nmol/L、100 nmol/L和250 nmol/L濃度PD0325901均能提高HDR效率，達2.6%~37.1% (圖3，E和F)，并表現明顯的劑量依賴效應。共轉染pX330--Cas9質粒和相應的ssODN，用dⅢ酶切方法評估基因編輯效率。結果顯示，25 nmol/L、50 nmol/L和250 nmol/L PD0325901促進位點HDR效率，分別提高了4.8%、0.8%和9.6% (圖3，H和I)，但100 nmol/L劑量時，位點HDR效率略微下降。進一步利用TA克隆和測序驗證，結果顯示，在250 nmol/L PD0325901劑量下和基因位點的HDR效率分別提高了48.16%和17.64% (表5；圖3，J和K)，與dⅢ酶切結果基本一致。

A：ssODN介導的HDR報告載體修復模式圖；B：報告載體HDR修復效率的流式細胞術檢測結果(用EGFP熒光細胞百分比表示HDR效率)；C：PD032590處理組間ssODN介導報告載體HDR修復的效率比較(=3)。*<0.05，表示差異顯著，**<0.01表示差異極顯著；D和G：ssODN介導dⅢ識別序列定點整合至豬基因組模式圖。D圖為基因位點，G圖為基因位點；E和H：核酸內切酶酶切法檢測位點(圖E)和位點(圖H)編輯效率電泳結果。T7 EndoⅠ為T7核酸內切酶Ⅰ酶切電泳圖，圖上的數字表示灰度掃描數值，代表目標位點發(fā)生DSB的效率；dⅢ為dⅢ限制性核酸內切酶酶切電泳圖，圖上數字表示灰度掃描數值，代表目標位點dⅢ定點整合效率；F和I：分別為圖E和圖H灰度掃描值的柱狀圖展示結果(HDR效率=dⅢ灰度掃描值/T7 EndoⅠ灰度掃描值，=3)；J和K：分別為定點整合dⅢ識別序列至(圖J)和(圖K)基因位點的測序峰圖。

表5 TA克隆數據統(tǒng)計

3 討論

細胞所在的分裂期會顯著影響DNA修復雙鏈斷裂途徑的選擇，在修復過程中，NHEJ可以發(fā)生在細胞分裂的任一時期，而HDR主要發(fā)生在S和G2期，李國玲等[17]通過同步化細胞周期至S和G2期，成功提高了基因組定點修飾的效率。Yang等[27]在人多能干細胞中添加ABT-751化合物，使細胞停滯在G2期，將2~5 kb片段整合至人基因組5個不同區(qū)域的效率提高了3~6倍；Lin等[28]添加aphidicolin和nocodazole，使人胚胎干細胞、成纖維細胞和293T細胞停滯在G2期，顯著提高ssODN介導的定向修復效率。本研究結果顯示，隨著PD0325901濃度增加，處于G2期和S期的PFFs細胞群顯著增加，處于G1期細胞群顯著減少，細胞表現一定程度的同步化，與前人的報道結果不一致[29~31]。Wang等[30]研究表明，RAS-RAF-MEK-ERK信號轉導通路通過激活MEK-ERK，促進細胞周期素D1 (cyclin D1)的表達及其與細胞周期依賴性激酶4 (cyclin-dependent kinase 4, Cdk4)的結合來調控細胞周期，促進細胞進入S期。Ayunadirah等[31]研究發(fā)現添加PD0325901顯著降低了MDA-MB-231乳腺癌細胞的增殖，同時發(fā)現細胞周期停滯在G1期。本研究用MEK抑制劑PD0325901處理PFFs后，檢測到S期細胞數量反而顯著增加，推測可能是由于MEK通路受到抑制后影響其他平行信號通路調控細胞周期，或細胞種類差異導致結果不一致，但具體機理尚不明確。已有的研究表明，添加小分子化合物PD0325901使細胞同步至S期和G2期，其可能有利于提高定點整合效率[17,32~34]。本研究結果也顯示，250 nmol/L濃度PD0325901能顯著提高報告載體、和位點上ssODN介導的同源修復效率，表明將細胞周期同步化在S和G2期可以提高細胞定向修復效率。

NHEJ和HDR通路的激活需要許多關鍵因子的參與，它們能調節(jié)修復途徑的選擇，并在修復過程中發(fā)揮不可替代的重要作用[17,35,36]。本研究結果顯示，不同濃度的PD0325901抑制劑均能提高報告載體、和位點上ssODN介導的同源修復效率，并表現明顯劑量依賴性。本研究結果推測，PD0325901上調和的表達可能是提高同源重組效率的關鍵，但PD0325901添加劑量與上述因子表達并沒有劑量依賴性關系，因而，二者間的相關性但仍需進一步研究。另外，PD0325901對NHEJ關鍵因子的表達也有不同程度的上調作用，尤其是25 nmol/L和250 nmol/L濃度影響較大，呈“U型效應”。在前人研究中也發(fā)現類似的現象，如Li等[17]在豬胎兒成纖維細胞中分別添加L755507、Resveratrol和Scr7 3種小分子抑制劑，NHEJ和HDR關鍵因子的表達水平出現了類似的“U型效應”。Kachhap等[37]在DU-145和LNCaP細胞中添加不同濃度梯度的丙戊酸(valproic acid, VPA)，基因的表達水平也同樣出現類似的“U型效應”。產生“U型效應”的原因可能是小分子濃度過高時，出現負反饋調節(jié)，其具體調控機理還有待進一步研究。同時，本研究利用PD0325901提高ssODN介導的同源修復效率，證實了MEK抑制劑PD0325901對豬體細胞HDR效率具有促進作用，與前人報道PD0325901可提高ESC定點整合效率結果一致[15]。本研究通過向豬成纖維細胞培養(yǎng)基中添加MEK抑制劑使EGFP報告載體的同源修復效率顯著提高了58.8%，使和26位點的同源重組效率分別提高了48.16%和17.64%，并表現較低的細胞毒性，這對提高PFFs細胞定向編輯效率及基因定向編輯豬的研究具有重要價值和意義。

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MEK inhibitor PD0325901 significantly boosts ssODN-mediated HDR efficiency in porcine fetal fibroblasts

Hao Ou1, Guoling Li1, Haoqiang Wang1, Guangyan Huang1, Gengyuan Cai1,2, Zicong Li1, Zhenfang Wu1,2, Xianwei Zhang1,2

There are two major pathways, homology-directed repair (HDR) and nonhomologous end joining (NHEJ), involved in double-strand break (DSB) repair.Single-stranded oligodeoxyribonucleotide (ssODN)-mediated homologous recombination repair is commonly used for animal site-directed genome editing, with great scientific and practical value. To improve ssODN-mediated HDR efficiency in the pig genome, we investigated the effect and molecular mechanism of mitogen-activated extracellular signal-regulated kinase (MEK) inhibitor PD0325901 on the HDR efficiency in porcine fetal fibroblasts (PFFs). The results showed that PD0325901 obviously increased the percentage of G2and S phase cell populations and reduced the cell population ratio in the G1phase of PFFs, and promoted the expression of HDR repair factor. At the optimal concentration of 250 nmol/L, PD0325901 increased the repair efficiency of ssODN-mediated GFP reporter vector by 58.8% and the directed editing efficiency of PFFandlocus by 48.16% and 17.64%, respectively. The results show that MEK inhibitor PD0325901 significantly promotes the efficiency of ssODN-mediated homologous-directed repair in the porcine genome, thus offering a new idea to generate genetically modified pigs more effectively.

MEK inhibitor; homologous-directed repair (HDR); PD0325901; gene editing

2018-10-29;

2019-03-02

國家自然科學基金項目(編號：31772555)和國家轉基因重大專項(編號：2016ZX08006002)資助[Supported by the National Natural Science Foundation of China (No.31772555) and the National Transgenic Major Projects (No.2016ZX08006002)]

歐浩，碩士，專業(yè)方向：動物遺傳育種。E-mail: 719367112@qq.com李國玲，博士，研究方向：基因編輯與遺傳育種。E-mail: 792268184@qq.com歐浩和李國玲并列第一作者。

張獻偉，博士，碩士生導師，研究方向：動物遺傳育種。E-mail: zxianw@163.com

10.16288/j.yczz.18-294

2019/3/26 9:24:44

URI: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20190326.0924.003.html

(責任編委: 任軍)