曹志紅 蔣靜 俞珊 楊秉芬 劉艷華 安紅娟 王若 翟斐 程小星

解放軍總醫(yī)院第八醫(yī)學(xué)中心全軍結(jié)核病研究所，1全軍結(jié)核病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/結(jié)核病診療新技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，2結(jié)核四科（北京100091）

結(jié)核?。╰uberculosis，TB）是傳染性疾病中第二位最常見的致死性原因［1］。據(jù)估計(jì)，2013年新發(fā)900萬例結(jié)核病，有150萬人死于結(jié)核?。?］。盡管人類結(jié)核分枝桿菌感染率很高，特別是在發(fā)展中國家，但只有5%～10%的感染者在其一生中有可能發(fā)展為活動性結(jié)核?。?-4］。結(jié)核分枝桿菌與宿主之間的相互作用在很大程度上決定了結(jié)核感染的發(fā)展和結(jié)果［3，5-7］。結(jié)核分枝桿菌主要感染肺部，但也會感染其它器官而引起肺外結(jié)核，結(jié)核性胸膜炎是最常見的肺外結(jié)核之一。黏膜相關(guān)恒定T細(xì)胞（mucosal-associated invariant T cell，MAIT cell）是一類表達(dá)恒定T細(xì)胞受體（TCR）α鏈的天然免疫樣T細(xì)胞，屬于進(jìn)化保守的T細(xì)胞，主要分布于外周血、腸道固有層淋巴組織、肝臟和肺臟中［8-10］，受進(jìn)化上保守的主要組織相容性復(fù)合物（MHC）樣分子MR1的限制。MAIT細(xì)胞可能通過生成細(xì)胞因子和細(xì)胞毒性效應(yīng)分子如IFN-γ、TNF-α、IL-17和Granzyme B等在人體抵御細(xì)菌和真菌感染過程中發(fā)揮重要作用，同時(shí)還參與多種炎癥性疾病的發(fā)病過程［11］。筆者對結(jié)核性胸膜炎患者胸腔積液中MAIT細(xì)胞對結(jié)核抗原免疫應(yīng)答生成的Granzyme B（Granzyme B+MAIT）情況及其與疾病轉(zhuǎn)歸的相關(guān)性進(jìn)行分析，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集2017年7-11月期間入住本院結(jié)核病研究所的25例首次入院結(jié)核性胸膜炎患者的胸水進(jìn)行分析，其中有10例在治療1～2周后重復(fù)收集胸水，分析CD8+T細(xì)胞亞群中Granzyme B+MAIT比例。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)按照2000年中華醫(yī)學(xué)會結(jié)核分會制定的《肺結(jié)核診斷和治療指南》，所有結(jié)核病患者均進(jìn)行胸部X線檢查，根據(jù)癥狀、分枝桿菌涂片及培養(yǎng)、PCR、病理檢查、T.SPOT-TB檢測結(jié)果和治療情況綜合確診，排除使用激素或其它影響免疫功能的疾病如HIV感染、移植術(shù)后、自身免疫病等。

1.3 試劑Ficoll密度梯度淋巴細(xì)胞分離液購自GE公司（USA），RPMI 1640培養(yǎng)液和AIM-V無血清培養(yǎng)液購自GIBCO公司（USA），胎牛血清（FBS）購自四季青公司，PBS購自索萊寶公司。LEAF純化的抗人CD28單克隆抗體（克隆CD28.2）、TCR Vα7.2-FITC（Cat號：351704）和 CD161-PE-cy7（339918）單克隆抗體及各自Isotype對照抗體購自Biolegend公司，CD3-ECD單克隆抗體（A07748）購自Beckman Coulter公司，CD8-PE-cy5單克隆抗體（555368）和Granzyme B-PE（561142）單克隆抗體及其Isotype對照抗體購自美國BD公司。Golgi plug、固定/破膜試劑盒購自美國BD公司。

1.4 方法

1.4.1 人胸水單個核細(xì)胞（PFMCs）的分離收集胸水，1 h內(nèi)進(jìn)行分離，室溫1 800 r/min×5 min離心。棄上清，加入RPMI 1640培養(yǎng)液重懸，室溫1 900 r/min×7 min離心。棄上清，加入5 mL RPMI 1640培養(yǎng)液重懸。然后進(jìn)行Ficoll密度梯度離心（室溫1 000 g，20 min）獲取 PFMCs，獲取的 PFMCs經(jīng)RPMI 1640培養(yǎng)液充分洗滌2次后，用AIM-V無血清培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為5×106/mL，加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔約1×106個PFMCs細(xì)胞（體積200 μL）。

1.4.2 PFMCs細(xì)胞的培養(yǎng)及抗原刺激每孔細(xì)胞懸液中加入結(jié)核分枝桿菌H37Rv裂解液（終濃度20 μg/mL），共刺激抗體CD28 200 ng。在5%CO2、37℃孵箱中孵育16～18 h，然后加入Golgi plug 0.2 μL，4～ 6 h后細(xì)胞內(nèi)因子染色。

1.4.3 熒光抗體染色取培養(yǎng)后細(xì)胞用含2%FBS的PBS洗滌（300 g，5 min），吸去上清。20 μl 2%FBS-PBS重懸混勻后，按抗體說明量分別加入CD3-ECD、CD8-PE-cy5、TCR Vα7.2-FITC和CD161-PE-cy7單克隆抗體，4℃避光染色30 min。再用含2%FBS的PBS洗滌（300 g，5 min）1次。加入250 μL固定破膜劑，4℃固定20 min；然后用1×破膜緩沖液洗滌一次（900 g，5 min），然后加入Granzyme B-PE單克隆抗體，4℃避光染色30 min，用1×破膜緩沖液洗滌一次，棄上清后重懸于300 μL 2%FBS-PBS中，4℃避光保存。同時(shí)采用各熒光標(biāo)記的同型對照，作為染色的背景水平。

1.4.4 流式細(xì)胞分析熒光抗體染色后，用流式細(xì)胞儀（Beckman coulter FC500）分析，獲取細(xì)胞數(shù)不少于100 000個。分析MAIT細(xì)胞中Granzyme B的表達(dá)，然后采用Beckman CXP軟件進(jìn)行分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法本文數(shù)據(jù)用（）表示，采用GraphPad Prism5軟件比較，兩組之間比較進(jìn)行非參數(shù)Mann-Whitney檢驗(yàn)，治療前后比較采用配對t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者人口統(tǒng)計(jì)學(xué)特征本試驗(yàn)共收集到25份胸水，全部都是新發(fā)結(jié)核病患者，其中男性18例，女性7例。年齡（35.32±2.64）歲。

2.2 MAIT細(xì)胞對結(jié)核抗原應(yīng)答生成的Gran?zymeB比例 從流式FSC/SSC散點(diǎn)圖中圈出淋巴細(xì)胞，然后選取CD3+CD8+群細(xì)胞設(shè)門，再選擇Vα 7.2+CD161high細(xì)胞作為MAIT細(xì)胞，分析Granzyme B的表達(dá)（圖1A）。經(jīng)結(jié)核分枝桿菌H37Rv裂解液抗原刺激后，結(jié)核性胸膜炎患者胸腔積液中GB+MAIT細(xì)胞比例為（25.34±5.37）%（圖1B）。

2.3 GranzymeB+MAIT細(xì)胞比例分組比較

2.3.1 年齡繪制Granzyme B+MAIT細(xì)胞比例與年齡的散點(diǎn)圖，發(fā)現(xiàn)沒有明確的相關(guān)性（圖2A）。將患者按年齡分成≤40歲和＞40歲兩組，各組Granzyme B+MAIT細(xì)胞比例分別為（24.58±5.46）%和（26.96±12.82）%，經(jīng)Mann Whitney檢驗(yàn)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（U=56.5，P=0.521 5）（圖2B）。

2.3.2 性別男性和女性患者胸水中Granzyme B+MAIT細(xì)胞比例分別為（25.02±6.29）%和（26.16±11.13）%，經(jīng)Mann Whitney檢驗(yàn)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（U=61.50，P=0.951 7，圖2C）。

圖1 Granzyme B+MAIT細(xì)胞比例Fig.1 Granzyme B+MAIT cell ratio

2.4 治療前后結(jié)核性胸腔積液中GranzymeB+MAIT細(xì)胞的變化 有10例在治療1～2周后重復(fù)收集胸水，其中7例治療效果好，Granzyme B+MAIT細(xì)胞比例明顯上升（圖3A、3B），治療前后比例分別為（30.41±2.78）%和（40.61±2.61）%，采用配對t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=9.867，P＜0.000 1，圖3C）。3例治療效果不好的患者Granzyme B+MAIT細(xì)胞比例明顯低于治療效果好的患者，且治療后比例上升不明顯，治療前后比例分別為（4.23±0.54）%和（6.60±0.61）%，差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.064，P=0.175 0，圖3D）。

3 討論

PORCELLI等［12］首先在腸黏膜淋巴組織中發(fā)現(xiàn)并提出了MAIT細(xì)胞這一概念。人MAIT細(xì)胞在外周血T細(xì)胞中占1%～10%，其T細(xì)胞受體（TCR）由一條半恒定的Vα7.2鏈組成，與有限數(shù)量的TCR β鏈配對。人MAIT細(xì)胞可以通過Vα7.2和CD161陽性表達(dá)來識別［13-14］。與傳統(tǒng)的CD4和CD8 T細(xì)胞與肽抗原發(fā)生反應(yīng)和CD1限制性T細(xì)胞識別含脂質(zhì)的抗原不同，MAIT細(xì)胞代表了一類新的T細(xì)胞，它們可以識別由主要組織相容性復(fù)合物（MHC）樣分子MR1提呈的微生物合成的維生素B代謝物而受到激活［15-18］。目前對MAIT細(xì)胞抗感染免疫方面的研究主要集中在外周血中，對感染局部作用的研究較少。

圖2 Granzyme B+MAIT細(xì)胞比例分組比較Fig.2 Granzyme B+MAIT cell ratio comparison between groups

圖3 治療前后Granzyme B+MAIT細(xì)胞比例比較Fig.3 Comparison of the proportion of Granzyme B+MAIT cells before and after treatment

MAIT細(xì)胞在抗微生物感染中通過生成效應(yīng)分子而發(fā)揮重要功能，如IFN-γ，腫瘤壞死因子（TNF）-α和IL-17。MAIT細(xì)胞在宿主抗分枝桿菌感染免疫中的功能主要在動物模型中進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)MAIT細(xì)胞通過產(chǎn)生IFN-γ能有效抑制巨噬細(xì)胞中牛分枝桿菌BCG的生長［19］。在小鼠分枝桿菌肺部感染中，MAIT細(xì)胞聚集至肺部，提供早期保護(hù)性免疫［20］。在人體中，活動性結(jié)核病患者外周血中MAIT細(xì)胞比例下降，但是在肺部和結(jié)核性腹膜炎患者的腹水中含量較高［21-22］，說明MAIT細(xì)胞能在感染部位明顯富集，而且結(jié)核性胸腔積液中MAIT細(xì)胞對結(jié)核分枝桿菌抗原的免疫應(yīng)答高于外周血［23］。提示MAIT細(xì)胞可能參與局部抗菌免疫，但是MAIT細(xì)胞如何發(fā)揮抗菌活性仍然不得而知。雖然已經(jīng)確定動物感染模型中MAIT細(xì)胞在對宿主分枝桿菌感染防御中起重要作用，但MAIT細(xì)胞在結(jié)核患者中的功能作用仍然很大程度上未知。顆粒酶B（Granzyme B）是一種絲氨酸蛋白酶，最常見于細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞（CTL）、天然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）和細(xì)胞毒性T細(xì)胞的顆粒中。它由這些細(xì)胞與穿孔素一起分泌，以介導(dǎo)靶細(xì)胞的細(xì)胞凋亡。有研究發(fā)現(xiàn)，MAIT細(xì)胞在未刺激情況下表現(xiàn)為靜息記憶表型，刺激后，通過上調(diào)效應(yīng)分子特別是Granzyme B的表達(dá)來發(fā)揮細(xì)胞溶解等效應(yīng)功能，進(jìn)而在傳染病和癌癥中發(fā)揮功能［24］。

在這項(xiàng)研究中，筆者調(diào)查了結(jié)核性胸膜炎患者胸腔積液中MAIT細(xì)胞的免疫應(yīng)答特征，經(jīng)結(jié)核分枝桿菌抗原刺激后，結(jié)核性胸膜炎患者胸腔積液中Granzyme B+MAIT比例為（25.34±5.37）%。男女性和不同年齡患者的Granzyme B+MAIT細(xì)胞比例均無顯著差異。7例治療效果好的患者治療后Granzyme B+MAIT細(xì)胞比例明顯上升，治療前后比例分別為（30.41±2.78）%和（40.61±2.61）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=9.867，P＜0.000 1）。3例治療效果不好的患者Granzyme B+MAIT細(xì)胞比例明顯低于治療效果好的患者，且治療后比例上升不明顯。

本研究發(fā)現(xiàn)結(jié)核性胸腔積液中MAIT細(xì)胞對結(jié)核抗原發(fā)生免疫應(yīng)答而生成Granzyme B，而且治療有效時(shí)Granzyme B量明顯升高，說明MAIT細(xì)胞可能通過顆粒酶B的細(xì)胞毒性殺傷作用而在局部抗結(jié)核免疫中發(fā)揮重要作用。