樊 濤, 郭彥偉, 任金山, 蘇書娟

(1南陽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校第一附屬醫(yī)院放療科， 河南 南陽 473000； 2鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院腫瘤科， 河南 鄭州 470000)

卵巢癌是婦科常見的惡性腫瘤之一，死亡率高，轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)率高。導(dǎo)致其高死亡率的主要原因是卵巢癌的起病隱匿，大多數(shù)患者確診時已到達晚期，并出現(xiàn)了遠端轉(zhuǎn)移，因此進行手術(shù)治療難以去除癌灶，只能采取放化療的規(guī)范性治療[1-2]。但放化療容易出現(xiàn)耐藥性，且統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明接受規(guī)范性治療的患者仍有約60%的復(fù)發(fā)率。因此如何克服放化療的耐藥性是目前卵巢癌治療研究中的重點問題。

紫草素(shikonin,Shk)是中藥紫草科紫草屬紫草的主要有效成分。已有研究表明紫草素具有抗炎、抗病毒、抗氧化、促進傷口愈合以及調(diào)節(jié)免疫功能等多種功效[3-4]。近年來，紫草素的抗腫瘤作用逐漸受到學(xué)者們的關(guān)注，已有報道指出紫草素對乳腺癌、宮頸癌和白血病等具有一定的抑制作用[5-7]。研究表明，紫草素可能通過上調(diào)Bax表達以及下調(diào)Bcl-2表達來抑制人卵巢癌細胞SKOV-3的體外增殖，并誘導(dǎo)其凋亡[8]。但鮮有紫草素對卵巢癌細胞放射敏感性的研究報道。本實驗通過體外培養(yǎng)人卵巢癌細胞株SKOV-3，采取紫草素與X射線聯(lián)合干預(yù)，探討紫草素對SKOV-3細胞的放射增敏作用并討論可能的作用機制。

材 料 和 方 法

1 實驗材料

人卵巢癌細胞株SKOV-3購自中國科學(xué)院上海細胞所。胰蛋白酶和RPMI-1640培養(yǎng)液購自HyClone；胎牛血清購自Gibco；MTT試劑、抗β-actin抗體和辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG(H+L)抗體購自碧云天生物技術(shù)有限公司；Shk購自中國藥品生物制品鑒定所；青霉素和鏈霉素購自華北制藥股份有限公司；碘化丙啶(propidium iodide,PI)購自上海聯(lián)碩生物科技有限公司；小鼠抗人p-PI3K、PI3K、p-AKT和AKT抗體購自Santa Cruz；其它試劑購自國產(chǎn)分析純。

2 方法

2.1細胞培養(yǎng) 向SKOV-3細胞株加入適量含10%胎牛血清、青霉素與鏈霉素各1×105U/L的RPMI-1640培養(yǎng)液，培養(yǎng)于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱。收集處于對數(shù)生長期的細胞，用0.25%胰酶消化，并調(diào)整細胞密度為2×109/L。

2.2SKOV-3細胞活力的檢測 收集處于對數(shù)生長期的SKOV-3細胞，調(diào)整細胞濃度為2×107/L，接種于96孔培養(yǎng)板中，加入紫草素使最終濃度為0、5、10、20、40、80和120 mg/L(其中以0 mg/L為空白對照組)，培養(yǎng)于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱48 h，加入MTT溶液繼續(xù)培養(yǎng)4 h，每孔加入二甲基亞砜150 μL，于570 nm處檢測吸光度(A)，并計算細胞相對活力。細胞相對活力(%)=(藥物組A值-空白對照組A值)/(對照組A值-空白對照組A值)×100%，每個濃度設(shè)3復(fù)孔，繪制存活曲線。

2.3克隆形成實驗 實驗分為2組，放射組：僅給予不同劑量(0、2、4、6和8 Gy)X射線照射處理；聯(lián)合組：給予8 mg/L紫草素和不同劑量(0、2、4、6和8 Gy)X射線照射處理。照射方法：將培養(yǎng)板放置于照射野(20 cm×20 cm)內(nèi)，直線加速器6 MV-X線照射，源皮距(SSD)為80 cm，劑量率為300 cGy/min。聯(lián)合組在照射前采用紫草素培養(yǎng)48 h，更換含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)7 d。PBS液洗滌2次，甲醛固定，吉姆薩液染色，晾干，計數(shù)。多靶單擊型模型公式SF=1-(1-e-D/D0)N擬合細胞存活曲線，其中SF為細胞存活分數(shù)，D為放射劑量(Gy)，D0代表平均致死劑量，N為外推數(shù)，lnN=Dq/D0，Dq代表準閾劑量。并計算放射增敏比(sensitization enhancement ratio,SER)，SER=D0放射組/D0聯(lián)合組。

2.4SKOV-3細胞周期的檢測 收集處于對數(shù)生長期的SKOV-3細胞，制成細胞懸液，調(diào)整濃度為2×107/L，實驗分4組：空白對照組(control組)、單藥組(Shk組，8 mg/L Shk)、照射組(8 Gy組，8 Gy X射線照射處理)和聯(lián)合組(Shk+8 Gy組，給予8 mg/L紫草素培養(yǎng)48 h后再進行 8 Gy X射線照射處理)。分別將加藥與照射完畢的細胞置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，收集細胞并調(diào)整濃度為1×109/L。800×g離心10 min，PBS洗滌2次，重懸細胞，加入4 μL碘化丙啶，采用流式細胞儀觀察細胞周期的變化。

2.5Western blot檢測相關(guān)蛋白表達 收集SKOV-3細胞，細胞裂解液裂解，提取細胞總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度，進行SDS-PAGE，電轉(zhuǎn)至PVDF膜，TBST液洗膜2次，將PVDF膜轉(zhuǎn)移至裝有封閉液的器皿中室溫下封閉2 h，TBST液洗膜3次，加入I抗(抗PI3K、AKT、p-PI3K、p-AKT和β-actin抗體，均按照1 ∶2 000稀釋)，4 ℃條件下孵育過夜，TBST液洗膜3次，加入相對應(yīng)的II抗辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG(H+L)抗體(1 ∶2 000稀釋)室溫孵育1 h，TBST液洗滌3次，化學(xué)發(fā)光法顯色，成像掃描分析系統(tǒng)保存圖像。

3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行處理。所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示。兩組間均數(shù)比較采用獨立樣本的t檢驗；多組均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 MTT法檢測SKOV-3細胞活力

在0～80 mg/L濃度范圍內(nèi)SKOV-3細胞活力隨紫草素濃度增大而降低，而80 mg/L與120 mg/L紫草素時SKOV-3細胞活力無差異，IC50為(38.54±0.57) mg/L，見圖1。后續(xù)實驗采用20%×IC50作為實驗研究濃度，即8 mg/L。

2 紫草素對SKOV-3細胞放射增敏作用

與放射組相比，經(jīng)過紫草素與X射線聯(lián)合處理后的SKOV-3細胞的存活曲線左移，放射生物學(xué)參數(shù)Dq、Do和N的值均降低，見表1、圖2。SER為1.45±0.05。

Figure 1.Effect of shikonin on the viability of SKOV-3 cells. Mean±SD.n=6.

圖1紫草素對SKOV-3細胞活力的影響

表1 紫草素對SKOV-3細胞放射生物學(xué)參數(shù)的影響

*P<0.05vsradiotherapy group.

Figure 2.Effect of shikonin on the survival curve of SKOV-3 cells. A: clone formation experiment； B: cell survival curve fitting using multi-target single-hit model. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsradiotherapy group.

圖2紫草素對SKOV-3細胞存活曲線的影響

3 紫草素對SKOV-3細胞周期分布的影響

流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，與control組相比，Shk組的SKOV-3細胞G2/M期比例無顯著差異；8 Gy組的SKOV-3細胞G2/M期所占比例顯著高于control組(P<0.05)；Shk+8 Gy組的SKOV-3細胞G2/M期所占比例顯著低于8 Gy組，卻顯著高于control組與Shk組(P<0.05)，見圖3。

4 PI3K與Akt蛋白表達及其磷酸化水平

以β-actin為內(nèi)參照，與control組相比，Shk組的p-PI3K和p-AKT蛋白表達水平略下降，但不具有統(tǒng)計學(xué)差異，經(jīng)過射線照射后，p-PI3K和p-AKT蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)，Shk聯(lián)合射線照射后，顯著降低p-PI3K和p-AKT蛋白表達水平(P<0.05)，見圖4。

討 論

實驗結(jié)果顯示在0～80 mg/L濃度范圍內(nèi)隨紫草素濃度增大，對SKOV-3細胞存活率的抑制作用逐漸增強，提示紫草素對卵巢癌細胞株細胞SKOV-3的增殖具有抑制作用。當(dāng)紫草素濃度到達約80 mg/L時，SKOV-3細胞隨紫草素濃度增加不再發(fā)生明顯改變，IC50為(38.54±0.57) mg/L。研究表明，理想的放射增敏劑本身對腫瘤組織作用不強且較小劑量即有放射增敏的作用[9]，因此常選用IC50的20%，即接近無毒濃度進行放射增敏研究，后續(xù)實驗中采用紫草素的濃度為8 mg/L。多靶單擊模型繪制SKOV-3細胞的存活曲線顯示，不同照射劑量聯(lián)合組的細胞存活率均低于放射組，提示紫草素具有增強X射線對卵巢癌細胞SKOV-3的殺傷作用；與放射組相比，聯(lián)合組的存活曲線往左下方偏移，Dq值減小，肩區(qū)減少，提示紫草素對卵巢癌細胞的亞致死性損傷修復(fù)能力減弱，D0值減少，提示紫草素具有增加卵巢癌細胞X射線敏感性的作用。

Figure 3.Effect of shikonin on cell cycle of SKOV-3 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vs8 Gy group.

圖3紫草素對SKOV-3細胞周期分布的影響

細胞的放射敏感性隨周期時相變化而有所不同，G2/M期的細胞對射線最為敏感，并在M期達到峰值，S期細胞對射線的敏感性最差，因此細胞處于G2/M期腫瘤細胞受到射線放射引起DNA損傷后，會導(dǎo)致細胞周期被阻滯于G1/S期或G2/M期，進行DNA損傷的修復(fù)[10]，未能成功修復(fù)則啟動凋亡信號使細胞產(chǎn)生凋亡[11]。研究顯示，當(dāng)細胞進入G2/M期，細胞的放射敏感性最高[11]。一般腫瘤細胞失去G1/S期檢測點的調(diào)控，放射誘導(dǎo)產(chǎn)生DNA損傷后顯示G2/M期阻滯[12]。而細胞G2/M期阻滯越明顯，越有利于細胞輻射后損傷的修復(fù)，對于腫瘤的放射治療不利。克隆形成實驗結(jié)果顯示，紫草素在一定程度上可以緩解X射線照射引起的SKOV-3細胞G2/M期阻滯，從而增加SKOV-3細胞的放射敏感性。推測紫草素通過降低SKOV-3細胞G2/M期阻滯，影響細胞有絲分裂周期及轉(zhuǎn)錄，從而發(fā)揮誘導(dǎo)細胞凋亡的作用。

Figure 4.Effect of shikonin on the protein levels of p-PI3K and p-AKT. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vs8 Gy group.

圖4紫草素對p-PI3K與p-AKT蛋白表達的影響

PI3K/AKT信號通路受多種因素，多個步驟調(diào)節(jié)，研究發(fā)現(xiàn)，AKT的Ser473位點磷酸化后，可激活其下游各種因子，進一步調(diào)節(jié)細胞各種生物學(xué)活動[13]。近年觀察在放射低敏感性腫瘤細胞中，PI3K/AKT信號通路存在過度激活的現(xiàn)象[14]。本實驗結(jié)果提示紫草素能夠降低SKOV-3細胞中PI3K和AKT的磷酸化水平，推測可能是通過抑制PI3K/AKT信號通路的激活，從而提高SKOV-3細胞的放射敏感性。

綜上所述，本實驗通過體外細胞學(xué)的研究，證實了紫草素對卵巢癌細胞SKOV-3具有提高放射敏感性的作用，其主要機制可能涉及到抑制PI3K/AKT信號通路和改變細胞周期分布。