王亞麗,宋振祥,顧 捷,白慧茹,周圓圓,張佳怡,楊 越,史唯一,陳麗琴*

(1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室,中國(guó)內(nèi)蒙古呼和浩特010030;2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院,中國(guó)內(nèi)蒙古呼和浩特010030)

個(gè)體識(shí)別和親權(quán)鑒定是法醫(yī)遺傳學(xué)鑒定的主要工作內(nèi)容。目前法醫(yī)DNA實(shí)驗(yàn)室普遍使用的遺傳標(biāo)記是短串聯(lián)重復(fù)序列(short tandem repeat,STR),但在實(shí)際案件中,STR存在突變率高、擴(kuò)增片段較長(zhǎng)、難以解決疑難降解檢材檢測(cè)風(fēng)險(xiǎn)等問(wèn)題。插入/缺失(insertion/deletion,InDel)作為第三代新型遺傳標(biāo)記,表現(xiàn)為DNA片段的插入或缺失形成的長(zhǎng)度多態(tài)性。2006年,第一張人類(lèi)基因組InDel多態(tài)性分型圖譜被繪制出來(lái),包括40多萬(wàn)個(gè)InDel遺傳標(biāo)記,平均密度為每7.2 kb堿基即可發(fā)現(xiàn)一個(gè)InDel位點(diǎn)[1]。InDel在全基因組中分布廣、數(shù)量多、密度大,在法醫(yī)遺傳學(xué)中具有極大的應(yīng)用潛能。同時(shí),InDel具有與單核苷酸多態(tài)性相近的突變率(1×10-8),明顯低于STR突變率(2×10-3),且穩(wěn)定性好,其擴(kuò)增序列(＜160 bp)明顯短于常用的STR[2～3],甚至短于miniSTR,因此更適用于高度降解等疑難生物檢材的檢測(cè)。此外,In-Del屬于長(zhǎng)度多態(tài)性標(biāo)記,可應(yīng)用目前通行的毛細(xì)管電泳分型平臺(tái)進(jìn)行檢測(cè),因此易于在實(shí)驗(yàn)室間普及[4]?？傊?InDel因其突變率低、擴(kuò)增片段短、數(shù)量多、易于檢測(cè)的特性而彌補(bǔ)了STR和單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)的不足,有望解決高度降解等疑難檢材的DNA檢測(cè),以及復(fù)雜個(gè)體識(shí)別和親權(quán)鑒定問(wèn)題,因而引起法庭科學(xué)領(lǐng)域的關(guān)注和積極探索。

本研究通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析30個(gè)常染色體InDel位點(diǎn)在內(nèi)蒙古赤峰地區(qū)蒙古族人群的遺傳多態(tài)性,積累了該地區(qū)的群體數(shù)據(jù),可為民族、種群遺傳關(guān)系研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣本

根據(jù)知情同意原則,采集50名內(nèi)蒙古赤峰地區(qū)蒙古族無(wú)關(guān)個(gè)體血樣,均為女性,年齡在20～60歲之間,載于FTA卡上。

1.2 主要試劑與儀器

Chelex-100(Bio-Rad公司,美國(guó));蛋白酶K(10 mg/μL)(Promega公司,美國(guó));Investigator DIP-plex試劑盒(Qiagen公司,德國(guó));Hi-Di formamide(Thermo Fisher公司,美國(guó))。

1.2 mm孔徑打孔器(Harris公司,美國(guó));9700型PCR擴(kuò)增儀(Thermo Fisher公司,美國(guó));3130型基因分析儀(Thermo Fisher公司,美國(guó))。

1.3 DNA提取

參照文獻(xiàn)[5]的方法應(yīng)用5%Chelex-100對(duì)FTA卡上的血樣進(jìn)行DNA提取。1)在1.5 mL離心管中加1 mL純水,然后加入血樣(用1.2 mm孔徑打孔器對(duì)FTA卡血樣進(jìn)行打孔取3片),小心混勻,放置30 min,間歇振蕩;2)10 000～15 000 r/min離心2～3 min,小心移去上清液。若樣品為血斑,則保留載體;3)沉淀中加入200 μL的5%Chelex-100,56℃保溫30 min;4)高速振蕩5～10 s,沸水浴 8 min;5)高速振蕩 5～10 s,10 000～15 000 r/min離心2～3 min,取上清液用于擴(kuò)增反應(yīng)。

1.4 PCR擴(kuò)增和電泳分型

參照Investigator DIPplex試劑盒說(shuō)明書(shū)[6],采用10 μL反應(yīng)體系對(duì) 30個(gè)常染色 InDel位點(diǎn)(HLD77、HLD45、HLD131、HLD70、HLD6、HLD111、HLD58、HLD56、HLD118、HLD92、HLD93、HLD99、HLD88、HLD101、HLD67、HLD83、HLD114、HLD48、HLD124、HLD122、HLD125、HLD64、HLD81、HLD-136、HLD133、HLD97、HLD40、HLD128、HLD39、HLD84)和性別位點(diǎn)Amelogenin進(jìn)行PCR擴(kuò)增。體系組成包括 Reaction Mix A 2.0 μL,Primer Mix 2.0 μL,Multi Taq2 DNA Polymerase 0.24 μL,DNA模板(10 ng/μL)1 μL,去離子水 4.76 μL。采用標(biāo)準(zhǔn)品9948作為陽(yáng)性對(duì)照,去離子水作為陰性對(duì)照。PCR條件：94℃預(yù)變性4 min;94℃變性30 s,61℃退火120 s,72℃延伸75 s,30個(gè)循環(huán);68℃終延伸60 min;10℃保溫∞。

PCR產(chǎn)物變性后在3130型基因分析儀上進(jìn)行毛細(xì)管電泳,體系為8.5 μL甲酰胺、0.5 μL分子量?jī)?nèi)標(biāo)Orange500和1 μL PCR產(chǎn)物。應(yīng)用Gene Mapper ID v3.2.1軟件對(duì)InDel位點(diǎn)進(jìn)行分型。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用 Modified-Powerstates.xls[7]和Cervus v3.0.7[8]對(duì)30個(gè)常染色I(xiàn)nDel位點(diǎn)進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)(PHWE),并完成等位基因分布頻率(Fdel：缺失多態(tài)性等位基因頻率;Fins：插入多態(tài)性等位基因頻率)、個(gè)體識(shí)別率(probability of discrimination power,DP)、多態(tài)信息含量(polymorphism information content,PIC)、匹配概率(match probability,MP)、典型父權(quán)指數(shù)(typical paternity index,TPI)、觀察值雜合度(heterozygosity of observation,Ho)及期望值雜合度(heterozygosity of expect,He)的計(jì)算。采用Arlequin軟件[8]完成InDel位點(diǎn)之間連鎖不平衡分析,以及內(nèi)蒙古赤峰蒙古族人群與內(nèi)蒙古鄂溫克族[9]、廣西蒙古族[10]、北京漢族[11]和新疆維吾爾族[12]4個(gè)群體相關(guān)InDel位點(diǎn)的等位基因頻率分布差異分析。參照文獻(xiàn)[13]的公式計(jì)算二聯(lián)體非父排除率(paternity exclusion for duo,PED)、三聯(lián)體非父排除率(paternity exclusion for trio,PET)、二聯(lián)體累計(jì)非父排除率(combined paternity exclusion for duo,CPED)、三聯(lián)體累計(jì)非父排除率(combined paternity exclusion for trio,CPET)、累計(jì)個(gè)體識(shí)別率(combined discrimination power,CDP)。

2 結(jié)果

2.1 30個(gè)InDel位點(diǎn)的基因分型情況

Investigator DIPplex試劑盒推薦的PCR擴(kuò)增體系為25 μL,在本研究中,嘗試采用10 μL的擴(kuò)增體積對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品9948進(jìn)行PCR擴(kuò)增和電泳檢測(cè),結(jié)果顯示電泳分型圖譜準(zhǔn)確(圖1)。在50名內(nèi)蒙古赤峰蒙古族無(wú)關(guān)個(gè)體中,30個(gè)InDel位點(diǎn)均得到有效擴(kuò)增,擴(kuò)增片段均在160 bp之內(nèi)。當(dāng)兩個(gè)等位基因相同時(shí)為純合子,表現(xiàn)為1個(gè)峰;當(dāng)兩個(gè)等位基因不同時(shí)為雜合子,表現(xiàn)為2個(gè)峰。圖2為一例內(nèi)蒙古赤峰蒙古族樣本的基因圖譜。

2.2 30個(gè)InDel位點(diǎn)的群體遺傳學(xué)參數(shù)

50名內(nèi)蒙古赤峰蒙古族人群無(wú)關(guān)個(gè)體在30個(gè)常染色I(xiàn)nDel位點(diǎn)上經(jīng)Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)后,除HLD83和HLD97位點(diǎn)外,其余InDel位點(diǎn)的P值均大于0.05。經(jīng)Bonferroni校正后,P值設(shè)為0.001 7(0.05/30),此時(shí)HLD83(P=0.011 1)和HLD97(P=0.014 9)的P值均大于0.001 7。因此,30個(gè)常染色I(xiàn)nDel位點(diǎn)均符合Hardy-Weinberg平衡。

圖1 Investigator DIPplex試劑盒陽(yáng)性對(duì)照9948分型圖譜Fig.1 The genetic typing of positive control 9948 with Investigator DIPplex kit

30個(gè)InDel位點(diǎn)的等位基因頻率及群體遺傳學(xué)參數(shù)見(jiàn)表1,其中Fdel為0.120 0～0.880 0,Fins為0.120 0～0.880 0,DP 為 0.309 6～0.658 4,PIC 為0.188 9～0.374 9,MP 為 0.341 6～0.690 4,TPI為0.568 2～1.470 6,Ho 為 0.120 0～0.660 0,PET為0.094 4～0.187 4。

圖2 一例內(nèi)蒙古赤峰蒙古族樣本的分型圖譜Fig.2 The genetic typing of one sample from Chifeng Mongolia population

30個(gè)InDel位點(diǎn)共進(jìn)行435次(435=[n(n-1)]/2,n=30)連鎖不平衡檢驗(yàn),其中,有17次的P值小于0.05。經(jīng)Bonferroni校正后,P值設(shè)為0.000 115(0.05/435),此時(shí),各位點(diǎn)之間均不存在連鎖不平衡現(xiàn)象,相互獨(dú)立。采用乘積原則計(jì)算,CPET為0.996 257 187 748,CPED為0.957 489 048 877,CDP為0.999 999 999 993。

2.3 30個(gè)InDel位點(diǎn)在內(nèi)蒙古赤峰蒙古族人群和其他群體的遺傳差異

內(nèi)蒙古赤峰蒙古族與4個(gè)群體(內(nèi)蒙古鄂溫克族、廣西蒙古族、新疆維吾爾族以及北京漢族)的等位基因頻率分布差異見(jiàn)表2。經(jīng)Bonferroni校正后,P值設(shè)為0.001 7(0.05/30),結(jié)果顯示：內(nèi)蒙古赤峰蒙古族與鄂溫克族和北京漢族人群在HLD40位點(diǎn)上的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與廣西蒙古族在HLD64位點(diǎn)上的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與新疆維吾爾族在HLD111、HLD56及HLD118位點(diǎn)上的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4 30個(gè)InDel位點(diǎn)在不同人群中的系統(tǒng)效能

通過(guò)查閱文獻(xiàn)資料,得到國(guó)內(nèi)12個(gè)群體的30個(gè)InDel位點(diǎn)的系統(tǒng)效能(CPE和CDP值)。對(duì)比本文研究的內(nèi)蒙古赤峰蒙古族與國(guó)內(nèi)12個(gè)群體(河南漢族[14]、北京漢族[11]、廣東漢族[15]、福建漢族[16]、江蘇漢族[17]、廣西蒙古族[10]、內(nèi)蒙古鄂溫克族[9]、福建畬族[18]、北京藏族[11]、新疆維吾爾族[12]、廣西壯族[10]與廣西哈薩克族[10])的30個(gè)InDel位點(diǎn)的系統(tǒng)效能(CPE和CDP值),CDP值從大到小依次為：新疆維吾爾族＞廣西哈薩克族＞福建畬族＞內(nèi)蒙古赤峰蒙古族＞北京藏族＞廣西蒙古族＞北京漢族＞內(nèi)蒙古鄂溫克族＞河南漢族＞廣東漢族＞福建漢族＞廣西壯族＞江蘇漢族;CPE值從大到小依次為：江蘇漢族＞內(nèi)蒙古赤峰蒙古族＞北京藏族＞新疆維吾爾族＞北京漢族＞河南漢族＞廣東漢族＞廣西哈薩克族＞廣西蒙古族＞廣西壯族＞內(nèi)蒙古鄂溫克族＞福建畬族＞福建漢族。具體數(shù)據(jù)信息見(jiàn)表3。

表1 30個(gè)常染色體InDel位點(diǎn)的等位基因頻率及群體遺傳學(xué)參數(shù)(n=50)Table 1 The forensic parameters and allele frequency of 30 autosomal InDel loci(n=50)

3 討論

Investigator DIPplex(Qiagen公司)是目前市面上第一款常染色體InDel的商品化試劑盒,包含30個(gè)常染色體InDel位點(diǎn)和1個(gè)性別鑒別基因座(Amelogenin),擴(kuò)增片段長(zhǎng)度均在160 bp以?xún)?nèi)。本文檢測(cè)結(jié)果顯示：內(nèi)蒙古赤峰蒙古族人群HLD111 位點(diǎn)的 Fins、Ho、He、DP、PIC、PET、PED及TPI值 均最小,HLD118 位點(diǎn)的 Fdel、He、PIC 及PET、PED值也較小,這兩個(gè)位點(diǎn)在已報(bào)道的河南漢族[14]、廣東漢族[15]、江蘇漢族[17]、福建漢族[16]及新疆維吾爾族[12]等群體中的等位基因頻率及群體遺傳學(xué)參數(shù)也較低,顯示這兩個(gè)位點(diǎn)在中國(guó)人群中的多態(tài)性較低。這可能與試劑盒開(kāi)發(fā)的針對(duì)人群(歐洲)及樣本數(shù)量的抽樣誤差有關(guān)。

Investigator DIPplex試劑盒包含的30個(gè)In-Del位點(diǎn)在內(nèi)蒙古赤峰蒙古族人群中具有較好的遺傳多態(tài)性,各位點(diǎn)間相互獨(dú)立,均不存在連鎖不平衡現(xiàn)象,其CDP值為0.999 999 999 993,達(dá)到常規(guī)STR檢測(cè)系統(tǒng)的CDP值(0.999 999 999 98)[19],可滿足法醫(yī)個(gè)體識(shí)別的要求,可獨(dú)立應(yīng)用于法醫(yī)實(shí)踐中的個(gè)體識(shí)別鑒定,且由于其片段長(zhǎng)度較小,所以也易于檢測(cè)嚴(yán)重降解的生物檢材。但是,30個(gè)InDel位點(diǎn)的CPET為 0.996,CPED為0.957,尚未達(dá)到13個(gè)CODIS STR檢測(cè)系統(tǒng)的CPE值(0.999 999 992以上)[20],因此尚不能單獨(dú)應(yīng)用于親權(quán)鑒定案件中。需要指出的是,由于其突變率較低,在STR出現(xiàn)突變的親子鑒定案件中,可以作為有效的補(bǔ)充標(biāo)記。

目前,國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)該試劑盒進(jìn)行了一系列群體遺傳學(xué)調(diào)查和法醫(yī)學(xué)應(yīng)用效能評(píng)估[9～19]。本文通過(guò)比較13個(gè)不同群體的系統(tǒng)效能發(fā)現(xiàn),這些群體的CDP值均大于0.999 999 9,其中新疆維吾爾族的CDP值最大,江蘇漢族的CDP值最小;但是CPE值最大僅0.997,其中江蘇漢族的CPE值最大,福建漢族的CPE值最小。此結(jié)果證實(shí)了該試劑盒在法醫(yī)學(xué)個(gè)體識(shí)別和親權(quán)鑒定中可作為STR輔助檢測(cè)工具的應(yīng)用價(jià)值。

表2 內(nèi)蒙古赤峰蒙古族與4個(gè)群體之間的等位基因頻率分布差異Table 2 Pairwise Fst and P values between the Chifeng Mongolia population and other 4 populations

表3 30個(gè)常染色體InDel位點(diǎn)在不同人群中的系統(tǒng)效能Table 3 The system performance of 30 autosomal InDel loci in different populations

遺傳距離(genetic distance)是通過(guò)兩個(gè)群體同一基因座上相同的等位基因頻率差異的函數(shù)來(lái)計(jì)量的[12],是群體間遺傳差異或分化的重要參數(shù)。最常用的指標(biāo)是Fst,又稱(chēng)為近交系數(shù),兩個(gè)群體間基因座的Fst值越大,表示該基因座在兩個(gè)群體間差異性越大。本研究結(jié)果顯示：內(nèi)蒙古赤峰蒙古族人群與鄂溫克族人群及北京漢族在HLD40位點(diǎn)上的Fst值較大,分別為0.152 0、0.217 3,其P值為(0.000 00±0.000 0)＜0.5,顯示其等位基因頻率分布具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;內(nèi)蒙古赤峰蒙古族人群與廣西蒙古族人群在HLD64位點(diǎn)上的Fst值最大,為 0.269 4,其 P值為(0.000 00±0.000 0)＜0.5;內(nèi)蒙古赤峰蒙古族人群與新疆維吾爾族人群在HLD111、HLD56和HLD118位點(diǎn)上的Fst值較大,其P值均為(0.000 00±0.000 0)＜0.5,顯示其等位基因頻率分布具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。中國(guó)是一個(gè)歷史悠久的多民族國(guó)家,隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展,人口的聚集、遷移與融合,單一民族的聚居格局逐漸被打破,形成“大雜居、小聚居”模式[21],使同一地區(qū)的不同民族間的遺傳差異越來(lái)越小。

綜上所述,內(nèi)蒙古赤峰蒙古族人群30個(gè)In-Del位點(diǎn)的等位基因頻率和群體遺傳學(xué)參數(shù)為內(nèi)蒙古地區(qū)蒙古族人群法醫(yī)學(xué)研究提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù),豐富了該群體的基因信息資源;InDel遺傳標(biāo)記可作為法醫(yī)物證鑒定工作的補(bǔ)充檢測(cè)標(biāo)記。