郭玉星，熊 輝，易法銀，朱方曉，陸小龍，周 彪，齊新宇，向黎黎，邵先舫

（1. 常德市第一中醫(yī)醫(yī)院 常德 415000；2. 湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院 長沙 410006；3. 湖南中醫(yī)藥大學(xué) 長沙 410208；4. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院 長沙 410005）

痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎為結(jié)晶尿酸鈉誘導(dǎo)關(guān)節(jié)及其周圍組織發(fā)生的急性炎癥反應(yīng)。痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎患病率與日俱增，全球成人發(fā)病率1%-6%[1]。秋水仙堿、非甾體抗炎藥等臨床抗痛風(fēng)化學(xué)藥物，易于引發(fā)肝腎損傷、骨髓抑制等不良反應(yīng)。痛風(fēng)屬中醫(yī)學(xué)“痹癥”、“歷節(jié)”等范疇，應(yīng)用四妙丸等古方可安全有效治療痛風(fēng)[2]。蠲痹歷節(jié)清方由蒼術(shù)、黃柏、黃芩等組成，具清熱、利濕、散瘀功效，為臨床驗(yàn)方，可顯著改善痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎癥狀，降低尿酸，且安全性高[3]。動物試驗(yàn)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，蠲痹歷節(jié)清方具有抗炎消腫作用，可減輕關(guān)節(jié)滑膜組織炎細(xì)胞浸潤，抑制炎癥因子IL-1β、IL-6、TNFα 表達(dá)[4-5]，并上調(diào)過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)，下調(diào)Toll 樣受體4(TLR4)、核轉(zhuǎn)錄因子kappa B(NF-κB)[6-8]，提示TLR4/NF-κB 信號通路可能參與了蠲痹歷節(jié)清方抗痛風(fēng)炎癥效應(yīng)。本研究在體外痛風(fēng)細(xì)胞模型上，采用藥血清藥理學(xué)方法，進(jìn)一步驗(yàn)證探究蠲痹歷節(jié)清方抗痛風(fēng)炎癥作用及其分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物及細(xì)胞

健康2月齡SPF級SD雄性大鼠10只（動物合格證號：SCXK＜湘＞2011-0003），體重200-220 g，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供。J774.1小鼠單核巨噬細(xì)胞（批號：CBR130812），購于賽齊（上海）生物工程有限公司。

1.1.2 藥物

造模藥物：尿酸鈉鹽為北京索萊寶科技有限公司Solarbio 產(chǎn)品（批號U8290），購于長沙凱諾生物科技有限公司。5 mg 尿酸鈉鹽加45 mL 生理鹽水，再加5 mL吐溫80，加熱攪拌，配成50 mL 尿酸鈉溶液，制成濃度100μg·mL-1的尿酸鈉溶液。

干預(yù)藥物：蠲痹歷節(jié)清方：蒼術(shù)20 g，黃柏10 g，黃芩10 g，土茯苓15 g，茵陳15 g，防己10 g，澤瀉10 g，白術(shù)10 g，當(dāng)歸15 g，甘草6 g 等。中藥由湖南中醫(yī)藥大學(xué)(湖南省中醫(yī)藥研究院）附屬醫(yī)院藥劑科進(jìn)行煎煮、濃縮至原藥濃度2.2 g·mL-1，用前加蒸餾水配成所需濃度。

陽性對照藥:①鹽酸吡格列酮（購于長沙凱諾生物科技有限公司，北京索萊寶科技有限公司Solarbio，批號：A0908AS）用1%梭甲基纖維素鈉（CMC-Na）按100 mg·50 mL-1制成混懸液。配制液置4℃冰箱中備用。②SN50（（MerckMillipore，購于上海優(yōu)寧維生物科技有限公司）:嚴(yán)格無菌條件下，SN50 溶于蒸餾水中，制成20μmoL·L-1濃度的混懸液，-20℃中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3 主要試劑

南美胎牛血清（購于長沙凱諾生物科技有限公司），DMEM（高）（購于長沙凱諾生物科技有限公司），青-鏈霉素（購于長沙凱諾生物科技有限公司）,細(xì)胞蛋白提取RIPA 裂解液（購于上海碧云天生物技術(shù)研究所）,TNF-α、IL-6、IL-1β（R&D）酶聯(lián)免疫分析試劑盒（購于安迪生物科技（上海）有限公司；試劑盒貨號分別為DZE20220，DZE20012，DZE20533；批號分別為201511，201511，201511）。 PPARγ，TLR4，NF- κB p65，β-肌動蛋白（β-actin）兔多克隆抗體，鼠抗兔二抗（美國Abcam 公司，批號分別為ab209350，ab13867，ab31482，ab209729，ab73400）。

1.2 方法

1.2.1 藥物血清制備

SD 雄性大鼠10 只（200± 20 g，清潔級；湖南中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供），隨機(jī)分為蠲痹歷節(jié)清含藥血清組和空白對照血清組，每組5只，按血清藥理學(xué)常規(guī)給藥方法：3 天-2 t（time）-1 h（hour）模式，以痛風(fēng)大鼠動物實(shí)驗(yàn)中得出的最有效劑量44 g·kg-1灌胃[9]?？瞻讓φ战M灌以等劑量生理鹽水，每日2 次，連續(xù)3天。末次給藥1 h 后，用10%水合氯醛按3.5 mL·kg-1量腹腔注射麻醉，經(jīng)腹主動脈采血。兩組均為無菌采血，在室溫下放置3 h，血液凝固后3000 rpm·min-1離心15 min，分別收集兩組大鼠血清，0.22μm 微孔濾膜過濾除菌，置-20℃冰箱凍存，備用。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將J774.1單核巨噬細(xì)胞株[10]于DMEM 高糖培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、100 U·mL-1青霉素、100μg·mL-1鏈霉素）的培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2、100%相對濕度溫箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長至約80%-90%匯合時(shí)，將細(xì)胞進(jìn)行1∶3傳代。

1.2.3 分組與干預(yù)

將細(xì)胞傳代至6孔板，24 h后，按隨機(jī)法分為6組，即正常對照組（A組）、模型組（B組）、PPARγ激動劑（C組）、NF-κB 阻斷劑組（D 組）、空白血清組（E 組）、蠲痹歷節(jié)清方組（F 組），每組設(shè)置5 個(gè)復(fù)孔。正常對照組培養(yǎng)液中不添加其它成分，模型組培養(yǎng)液中添加終濃度為100μg·mL-1尿酸鈉[6]；PPARγ 激動劑組培養(yǎng)液中添 加 終 濃 度 為100 μg·mL-1尿 酸 鈉，20 μmol·L-1PPARγ 激動劑吡格列酮；NF-κB 阻斷劑組培養(yǎng)液中添加終濃度為100μg·mL-1尿酸鈉，20μmol·L-1NF-κB阻斷劑SN50；空白血清組培養(yǎng)液中，添加終濃度為100μg·mL-1尿酸鈉，10%的大鼠空白血清。蠲痹歷節(jié)清方組添加終濃度為100μg·mL-1尿酸鈉，10%的大鼠蠲痹歷節(jié)清方含藥血清，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.2.4 巨噬細(xì)胞中TNF-α、IL-1β、IL-6含量測定

收集每孔細(xì)胞上清液，采用酶聯(lián)免疫法吸附測定（ELISA），嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.2.5 巨噬細(xì)胞中PPARγ、TLR4 基因表達(dá)的檢測（RT-PCR法）[8]

按照總RNA提取試劑盒說明書提取總RNA，瓊脂糖凝膠電泳以及紫外分光光度儀測定RNA的完整性，按Fermentas 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行總RNA 逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)，再以cDNA 為模板，與基因特異性引物，通過PCR 擴(kuò)增TLR4、PPARγ mRNA。TLR4、PPARγ、actin的 退 火 溫 度 分 別 設(shè) 為：58℃、55℃、59℃。PPARγmRNA、TLR4mRNA 及β-actin mRNA 的擴(kuò)增片段分別為189 bp，112 bp，225 bp。將各樣本通過凝膠成像和圖形分析，得出各條帶的光密度值，結(jié)果以相對系數(shù)= 目的基因（PPARγ、TLR4）mRNA 光密度·βactin mRNA 光密度值，作為目的基因mRNA 的相對表達(dá)量。TLR4、PPARγmRNA 所用引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成，見表1。

表1 引物序列

1.2.6 巨噬細(xì)胞中PPARγ、TLR4 蛋白表達(dá)的檢測（Western-Blot法）[8]

提取總蛋白，BCA 法測定蛋白質(zhì)濃度，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，一抗孵育，二抗孵育，ECL 顯色曝光，將圖像掃描用凝膠圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行信號分析，以β-actin蛋白的光密度值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)校正，計(jì)算蛋白產(chǎn)物的相對量。

1.2.7 NF-κB核移位情況（免疫熒光法）[10]

細(xì)胞分組及處理方法同前，一抗稀釋（1∶200），1∶500 稀釋TRITC 熒光標(biāo)記二抗，圖像采集在激光共聚焦顯微鏡下進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（xˉ± s）表示，采用SPSS 16.0軟件處理。兩組間結(jié)果比較，若方差齊時(shí)采用LSD法，方差不齊時(shí)采用Dunnett T3法進(jìn)行方差分析，不滿足正態(tài)性及方差齊性時(shí)采用秩和檢驗(yàn)。以P ＜0.05為差異顯著具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 蠲痹歷節(jié)清方含藥血清干預(yù)巨噬細(xì)胞活性的量效關(guān)系（OD值）

2 結(jié)果

2.1 蠲痹歷節(jié)清方含藥血清加入量的選擇

采用MTT 法檢測不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的含藥血清培養(yǎng)J774.1 巨噬細(xì)胞，以各組OD 值來分析。干預(yù)前，巨噬細(xì)胞OD 值無明顯差異（P ＞0.05）；各組巨噬細(xì)胞OD值，10%，15%，20%均明顯高于5%（P ＜0.01）；含藥血清組，10%與15%相比無明顯差異（P ＞0.05），但隨著含藥血清濃度的增加，巨噬細(xì)胞OD 值明顯降低（P ＜0.01）。因選擇含藥血清10%作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的干預(yù)濃度，同時(shí)空白血清組對應(yīng)選取10% 的無含藥血清。（表2）

2.2 巨噬細(xì)胞中TNF-α、IL-1β、IL-6水平比較

與正常對照組比較，模型組巨噬細(xì)胞中TNF-α、IL-1β、IL-6 水平顯著增高（P ＜0.01），說明尿酸鈉可誘導(dǎo)J774.1單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生炎性反應(yīng)。與模型組相比，空白血清組各炎性因子比較無明顯差異（P ＞0.05），說明大鼠血清對試驗(yàn)無明顯干擾；與模型組比較，NF-κB 阻斷劑組、PPARγ 激動劑組、蠲痹歷節(jié)清方組TNF-α、IL-1β、IL-6 水平均顯著降低（P ＜0.01），說明NF-κB 阻斷劑SN50、PPARγ 激動劑吡格列酮、蠲痹歷節(jié)清方均可以抑制尿酸鈉誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞發(fā)生的炎癥反應(yīng)。

2.3 蠲痹歷節(jié)清方對巨噬細(xì)胞中PPARγ、TLR4 基因表達(dá)的影響

與正常對照組比較，模型組PPARγ mRNA 表達(dá)降低（P ＜0.05），TLR4 mRNA 表達(dá)顯著升高（P ＜0.01）。

表3 各組巨噬細(xì)胞中TNF-α、IL-1β、IL-6變化的比較（xˉ± s，pg·mL-1）

圖1 各組巨噬細(xì)胞中PPARγ、TLR4和β-actin mRNA表達(dá)水平

表4 各組巨噬細(xì)胞中PPARγ、TLR4mRNA表達(dá)的比較（目的基因光密度/內(nèi)參基因光密度, n = 6）

表4 各組巨噬細(xì)胞中PPARγ、TLR4mRNA表達(dá)的比較（目的基因光密度/內(nèi)參基因光密度, n = 6）

注：與正常對照組相比，◆P ＜0.05，◆◆P ＜0.01；與模型組相比，▲P ＜0.05，▲▲P ＜0.01。

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圖2 各組巨噬細(xì)胞中PPARγ、TLR4和β-actin蛋白表達(dá)水平

表5 各組巨噬細(xì)胞中PPARγ、TLR4蛋白表達(dá)的比較（目的蛋白光密度/內(nèi)參蛋白光密度，xˉ± s，n=6）

與模型組相比，PPARγ 激動劑組、蠲痹歷節(jié)清方組PPARγ mRNA 的表達(dá)顯著升高（P ＜0.01），TLR4 mRNA 的表達(dá)顯著降低（P ＜0.01）；與模型組比較，NF-κB阻斷劑組PPARγ mRNA的表達(dá)無明顯差異（P ＞0.05），TLR4mRNA有所減少（P ＜0.05）（圖1，表4）。

2.4 蠲痹歷節(jié)清方對巨噬細(xì)胞中PPARγ、TLR4 蛋白表達(dá)的影響

與正常對照組比較，模型組PPARγ蛋白表達(dá)降低（P ＜0.05），TLR4蛋白表達(dá)顯著升高（P ＜0.01）。與模型組相比，PPARγ 激動劑組、蠲痹歷節(jié)清方組PPARγ蛋白的表達(dá)顯著升高（P ＜0.01），TLR4 蛋白的表達(dá)顯著降低（P ＜0.01）；與模型組比較，NF-κB 阻斷劑組PPARγ 的表達(dá)無明顯差異（P ＞0.05），TLR4 蛋白表達(dá)降低（P ＜0.05）。此結(jié)果與RT-PCR 檢測結(jié)果一致。（圖2，表5）。

2.5 NF-κB核移位情況

正常培養(yǎng)的J774.1巨噬細(xì)胞NF-κB p65主要表達(dá)在細(xì)胞漿，鏡下呈紅色熒光，核表達(dá)很少，而模型組紅色熒光主要表達(dá)于細(xì)胞核，胞漿表達(dá)明顯減少[10]。正常對照組中NF-κB p65 主要集中在細(xì)胞漿，細(xì)胞核中表達(dá)較少，模型組及空白血清組中NF-KB p65 主要集中在細(xì)胞核中，細(xì)胞漿中較少，NF-κB 阻斷劑組、PPARγ 激動劑組、蠲痹歷節(jié)清方組NF-κB p65 主要在細(xì)胞漿中，細(xì)胞核中相對較少，未出現(xiàn)明顯NF-κB 核移位情況，說明NF-κB 阻斷劑SN50、蠲痹歷節(jié)清方、PPARγ 激動劑吡格列酮組均可抑制NF-κB 核移位（圖3）。

3 討論

本研究采用中藥血清藥理學(xué)方法，在體外痛風(fēng)樣巨噬細(xì)胞模型上，發(fā)現(xiàn)蠲痹歷節(jié)清方可能部分通過上調(diào)巨噬細(xì)胞PPARγ 轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，抑制TLR4·NF-κB-1信號通路，最終抑制痛風(fēng)炎癥反應(yīng)。作為依據(jù)，蠲痹歷節(jié)清方可降低痛風(fēng)細(xì)胞模型中TNF-α、IL-1β、IL-6水平，上調(diào)PPAR γ 基因轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，下調(diào)TLR4 基因轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，同時(shí)抑制NF-κB 核移位。蠲痹歷節(jié)清方體外抗痛風(fēng)炎癥作用，與PPARγ 激動劑類似，也與蠲痹歷節(jié)清方前期動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致[8]。

圖3 各組巨噬細(xì)胞中NF-κB核移位情況

急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎是由尿酸鈉結(jié)晶脫落進(jìn)入關(guān)節(jié)腔，作用于巨噬細(xì)胞、滑膜細(xì)胞等，釋放如IL-1β 等多種炎癥介質(zhì)，進(jìn)而引起炎癥級聯(lián)反應(yīng)[11]。本研究采用尿酸鈉誘導(dǎo)J744.1單核巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)作為痛風(fēng)模型，參照Putra[10]等方法建立，模型組巨噬細(xì)胞中TNF-α、IL-1β、IL-6 水平較正常對照組顯著增高，提示尿酸鈉已誘導(dǎo)J744.1單核巨噬細(xì)胞發(fā)生痛風(fēng)樣急性炎癥反應(yīng)，細(xì)胞模型可靠。臨床研究發(fā)現(xiàn)，TLR4·NFκB-1信號通路密切參與了急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制[6]，且PPARγ 激動劑可通過競爭性抑制TLR4·NFκB-1通路，抑制炎癥反應(yīng)[7]。本研究也發(fā)現(xiàn)，與正常對照組比較，尿酸鈉誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞PPARγ基因轉(zhuǎn)錄與表達(dá)顯著降低，TLR4 基因轉(zhuǎn)錄與表達(dá)顯著增加，NF-κB核移位，而NF-κB 阻斷劑組SN50、PPARγ 激動劑吡格列酮，均可降低巨噬細(xì)胞分泌TNF-α、IL-1β、IL-6 的水平，抑制TLR4基因轉(zhuǎn)錄與蛋白表達(dá)，以及NF-κB 活化核移位，提示，PPARγ 及TLR4·NF-κB 信號通路也參與了本痛風(fēng)細(xì)胞模型。此發(fā)現(xiàn)，與Qing[6]等實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。

本實(shí)驗(yàn)制備含藥血清采用的灌胃劑量44 g·kg-1是在前期體外大鼠痛風(fēng)模型中得出的最佳有效劑量[9]，此劑量為8倍臨床等效劑量。本研究采用的10%含藥血清濃度，是通過MTT 法檢測得出最適宜血清濃度，符合血清藥理學(xué)一般試驗(yàn)方法。本研究中，蠲痹歷節(jié)清方含藥血清，可增加PPARγ 基因轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，降低TLR4 基因轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，阻止NF-κB 核移位，其作用與吡格列酮相似，進(jìn)一步揭示，蠲痹歷節(jié)清方，可能部分通過上調(diào)巨噬細(xì)胞PPARγ 轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，抑制TLR4·NF-κB信號通路，抑制痛風(fēng)炎癥反應(yīng)。

蠲痹歷節(jié)清方，是否可通過MyD88(myeloid differentiation factor 88)等其他信號途徑尚不明確，蠲痹歷節(jié)清方分子藥理機(jī)制-中醫(yī)方證關(guān)聯(lián)探討研究及蠲痹歷節(jié)清方分子藥理機(jī)制-方藥關(guān)聯(lián)研究，在本次實(shí)驗(yàn)中也未進(jìn)行深入探討，需要在以后研究中加強(qiáng)拓展。

綜上所述，本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，蠲痹歷節(jié)清方可能部分通過上調(diào)巨噬細(xì)胞PPARγ 轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，抑制TLR4·NF-κB-1信號通路，抑制痛風(fēng)炎癥反應(yīng)。此發(fā)現(xiàn)為蠲痹歷節(jié)清方臨床治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎提供了實(shí)驗(yàn)科學(xué)支持，為中醫(yī)清熱利濕散瘀法治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎提供了理論參考依據(jù)。