張 雪，陳大霞，趙 楠，李隆云＊＊

（1. 重慶市中藥研究院，重慶 400065；2. 重慶醫(yī)藥高等專科學(xué)校，重慶 401331；3. 重慶市中藥良種選育與評價(jià)工程技術(shù)研究中心 重慶 400065；4. 中國中醫(yī)科學(xué)院中藥資源中心重慶分中心 重慶 400065）

玄參Scrophularia ningpoensis Hemsl.別名黑參、元參、浙玄參，為玄參科多年生草本植物。玄參具有清熱涼血、養(yǎng)陰生津、瀉火解毒的功效[1]。玄參的繁殖方法主要有分株、種子、扦插等，但是，玄參生產(chǎn)上主要采用子芽（也叫根芽、芽頭）繁殖方式。而對玄參種子的研究主要是發(fā)芽條件及檢驗(yàn)規(guī)程等方面[2-3]，玄參種子的質(zhì)量分級標(biāo)準(zhǔn)的研究還未見報(bào)道。目前，絕大部分中藥材種子還沒有相應(yīng)的種子檢驗(yàn)規(guī)程和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，無法對市場上的種子的質(zhì)量進(jìn)行檢驗(yàn)，造成了中藥材種子市場混亂、種子質(zhì)量良莠不齊等問題，亟待制定規(guī)范化的種子質(zhì)量分級標(biāo)準(zhǔn)。因此，開展種子質(zhì)量檢驗(yàn)研究，制定種子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和檢驗(yàn)規(guī)程，是國家推進(jìn)中藥材規(guī)范化種植工作的一項(xiàng)中藥任務(wù)。本研究對29 個(gè)玄參主產(chǎn)地的玄參種子進(jìn)行了凈度、千粒重、發(fā)芽率、發(fā)芽勢、含水量、生活力等6個(gè)種子質(zhì)量分級指標(biāo)的測定，初步制定了玄參種子質(zhì)量分級標(biāo)準(zhǔn)。為規(guī)范玄參藥材質(zhì)量提供了有力的保障。

1 材料

本實(shí)驗(yàn)玄參種子采自重慶，湖北，四川等地，所采的種子經(jīng)重慶市中藥研究院李隆云研究員鑒定為玄參種子。種子具體產(chǎn)地見表1。

2 方法

2.1 種子性狀測定

將29 個(gè)不同產(chǎn)地玄參種子自然陰干，充分震蕩，種子自然脫落，過18 目篩以便除去篩上的干燥果皮，再過60目篩除去篩下的塵土，手工隨機(jī)數(shù)取若干種子作為種子質(zhì)量分級的樣品。隨機(jī)選取上述不同產(chǎn)地玄參種子100 粒，設(shè)3 個(gè)重復(fù)，共300 粒。在顯微鏡下逐粒觀察并記錄玄參種子的形態(tài)特征，種子外觀性狀指標(biāo)主要包括：形狀、大?。ㄓ梅N子長、寬、厚表示）、顏色、表皮構(gòu)造等。

表1 玄參種子分級實(shí)驗(yàn)材料

2.2 凈度分析

凈度分析試驗(yàn)樣品不少于2500 粒種子[4]，確定玄參種子凈度分析試驗(yàn)的質(zhì)量為0.5 g。采用“四分法”取試驗(yàn)樣品，在凈度分析臺上將試樣分離成干凈種子、其他植物種子和一般雜質(zhì)3 種成分。將分離后的各成分分別稱重，精確至0.01 g，計(jì)算凈種子的百分率，重復(fù)3次。千粒重、發(fā)芽率、發(fā)芽勢、含水量及生活力測定均使用凈種子。

2.3 千粒重測定

采用千粒法及四分法取樣，將干凈種子分成4份，從每份中隨機(jī)取樣250 粒，共1000 粒，3 次重復(fù)，用0.0001電子天平稱重，稱重后計(jì)算各組平均值。

2.4 發(fā)芽率及發(fā)芽勢測定

隨機(jī)選取上述不同產(chǎn)地玄參凈種子300 粒，設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)100粒，將種子擺放在鋪有三層濾紙的培養(yǎng)皿中，加蓋，放入光照培養(yǎng)箱中，于25℃條件下進(jìn)行培養(yǎng)，每天定時(shí)檢查并給培養(yǎng)皿中澆水，保持濾紙濕潤。萌發(fā)7 天統(tǒng)計(jì)發(fā)芽數(shù)并計(jì)算發(fā)芽勢，14 天統(tǒng)計(jì)最終發(fā)芽率。

發(fā)芽率、發(fā)芽勢計(jì)算公式如下[5]：

2.5 生活力測定

采用電導(dǎo)率法測定。隨機(jī)取29 個(gè)不同產(chǎn)地玄參凈種子0.2 g，放入20 mL 無離子水中，均勻攪拌，在20～30℃下浸泡24 h，設(shè)3 次重復(fù)。以蒸餾水為對照，用電導(dǎo)率測定對照和種子浸出液的電導(dǎo)率，樣品電導(dǎo)率減去對照電導(dǎo)率，得出式樣的值。計(jì)算樣品電導(dǎo)率的值：

電導(dǎo)率=(樣品1 的值/樣品1 的種子質(zhì)量+樣品2的值/樣品2 的種子質(zhì)量+樣品3 的值/樣品3 的種子質(zhì)量)/3

2.6 含水量測定

采用105℃恒溫烘干法。設(shè)3 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)4～5 g。烘干過程中，每隔1 h 取出迅速放入干燥器中冷卻至室溫稱重。直到前后2 次重量不超過0.01 g 為止，以最后一次重量作為烘干后的重量，計(jì)算種子水分百分率。

2.7 種子分級標(biāo)準(zhǔn)制定

使用SPSS12.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件，對凈度、千粒重、發(fā)芽率、發(fā)芽勢、生活力、含水量數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)分析后，結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際和可操作性，確定玄參種子質(zhì)量分級的指標(biāo)，將指標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)化后，使用k均值分類法對觀測量進(jìn)行快速樣本聚類，得出玄參種子質(zhì)量分級標(biāo)準(zhǔn)。

2.8 玄參種子等級發(fā)芽試驗(yàn)

2.8.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)地選在重慶市武隆縣仙女山鎮(zhèn)荊竹村楊家壩玄參種植基地。位于東經(jīng)107°41'、北緯29°25'，海拔1300 m，屬亞熱帶濕潤季風(fēng)氣候，氣候溫和，年平均氣溫17.9℃，最低月平均氣溫6.6℃，最高月平均氣溫27.5℃。供試土壤為沙壤土，土層深厚、疏松肥沃、排水良好。2007年至2009年未栽培過玄參，前茬作物為玉米。試驗(yàn)地土壤pH 5.29，其基本理化性質(zhì)為：有機(jī)質(zhì)量為30.21 g/kg，全氮量為2.21 g/kg，全磷量為0.15 g/kg，全鉀量為13.77 g/kg，速效氮量為117.3 mg/kg，速效磷量為5.37 mg/kg，速效鉀量為2.19 mg/g。

2.8.2 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用玄參種子為已分好等級的玄參種子，每個(gè)產(chǎn)地設(shè)三個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)50粒。

2.8.3 試驗(yàn)方法

栽培前將地整平耕細(xì)，整成長1 m，高10 cm，寬1 m的小廂，為了利于排水和管理，四周開好寬20 cm 的排水溝。廂面上均勻撒種，一廂作為一個(gè)重復(fù)，撒種后覆一層細(xì)土，澆水保濕保溫，促進(jìn)發(fā)芽生長。

2.8.4 采樣方法

待幼苗長有6 ～8片葉子時(shí)，統(tǒng)計(jì)不同等級玄參種子的成活情況，計(jì)算田間出苗率，每個(gè)試驗(yàn)小區(qū)隨機(jī)選20株作為觀測植株，測量其株高、主莖莖粗、植株鮮重（烘干得到其植株干重，計(jì)算其壯苗指數(shù)，株高用直尺測量，精確到0.1 cm，莖粗用游標(biāo)卡尺測量，精確到0.01 mm。用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件對生長指標(biāo)進(jìn)行差異顯著性分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 種子真實(shí)性鑒定

玄參種子呈不規(guī)則橢圓形，長0.76 ～0.98 mm，寬0.38 ～0.54 mm，厚0.28 ～0.43 mm，黑褐色，在顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)種皮表面呈網(wǎng)狀型并有凹陷，質(zhì)脆堅(jiān)硬。

3.2 不同產(chǎn)地玄參種子質(zhì)量檢測結(jié)果分析

29 個(gè)產(chǎn)地玄參種子的凈度、千粒重、發(fā)芽率、發(fā)芽勢、生活力、含水量等指標(biāo)質(zhì)量檢測結(jié)果見表2。從表2 可以看出，不同產(chǎn)地玄參種子各個(gè)質(zhì)量檢測指標(biāo)的變化規(guī)律與產(chǎn)地基本沒有相關(guān)性。不同地方玄參種子的凈度均在90%以上，玄參種子樣品中的雜質(zhì)多為殘存果夾或短小花枝，一般不摻和其他植物種子及重型混雜物，廢種子含量的高低直接決定種子凈度。不同地方玄參種子的千粒重范圍為0.138 ～0.196 g，差異顯著，平均值為0.167 g，變異系數(shù)為11.4%。不同地方玄參種子發(fā)芽率差異明顯，發(fā)芽率的范圍為57.0% ～86.7%，除19 號、20 號以外，其他產(chǎn)地發(fā)芽率均在60%以上，17 號最大，達(dá)到了86.7%。各產(chǎn)地玄參種子發(fā)芽率差異顯著，平均值為70.7%，變異系數(shù)為10.8%。不同地方玄參種子發(fā)芽勢差異明顯，發(fā)芽勢的范圍為41.5% ～70.8%，大部分產(chǎn)地玄參種子發(fā)芽勢在50%以上，同樣是17 號種子的發(fā)芽勢最大，達(dá)到了70.8%。發(fā)芽勢與發(fā)芽率的變化趨勢相似，發(fā)芽勢高說明種子的發(fā)芽速度快、發(fā)芽整齊，表示種子生活力強(qiáng)。電導(dǎo)率與發(fā)芽率基本呈反比。因種子在水中浸泡后，體內(nèi)電解質(zhì)會滲透出細(xì)胞膜，細(xì)胞膜的完整性越低，則進(jìn)入浸泡液的電解質(zhì)越多，浸泡液的電導(dǎo)率就越高，對應(yīng)的種子活力越低。不同產(chǎn)地玄參種子生活力的范圍為0.428 ～0.886，差異顯著，平均值為0.67，變異系數(shù)為19.7%。17 號電導(dǎo)率最小，僅為0.428 μS／(cm2·g)，表明種子的活力最高。29 份玄參種子含水量差異不顯著，變化范圍為8.25 ～11.05%，平均值為9.59%，變異系數(shù)僅為6.7%。

表2 玄參種子質(zhì)量檢測結(jié)果

表3 玄參種子質(zhì)量指標(biāo)間的相關(guān)分析

表4 玄參種子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

表5 不同等級玄參種子的壯苗效果

3.3 玄參種子質(zhì)量指標(biāo)間的相關(guān)分析

玄參種子各質(zhì)量指標(biāo)間的相關(guān)性分析結(jié)果見表3。其中發(fā)芽率、發(fā)芽勢、凈度、生活力及千粒重之間均呈顯著相關(guān)，含水量與其他指標(biāo)間沒有相關(guān)性，說明在安全含水量范圍內(nèi)，玄參種子品質(zhì)與含水量不相關(guān)。凈度與發(fā)芽率、發(fā)芽勢的相關(guān)系數(shù)分別為0.628和0.513，說明凈度在某種程度上能夠反映玄參種子內(nèi)在品質(zhì)。結(jié)合相關(guān)性分析結(jié)果以及生產(chǎn)實(shí)際和可操作性，本研究以發(fā)芽率、凈度、千粒重作為玄參種子質(zhì)量分級的重要指標(biāo)。

3.4 玄參種子質(zhì)量分級標(biāo)準(zhǔn)的初步制定

本研究采用快速樣本聚類分析的數(shù)學(xué)方法進(jìn)行分級，k 均值分類法執(zhí)行快速樣本聚類命令，使用歐氏距離公式來確定不同級別間的距離，距離越小則相似程度越大[6]。

以玄參種子千粒重，發(fā)芽率，凈度3項(xiàng)指標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)化值進(jìn)行k 類中心聚類分析，結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際和可操作性，初步制訂了玄參種子質(zhì)量分級標(biāo)準(zhǔn)見表4。分級方法采用最低定級原則，即任何一項(xiàng)不符合規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)都不能定為相應(yīng)等級的合格子芽。Ⅰ級、Ⅱ級和Ⅲ級以外的種子為不合格種子。

3.5 不同等級種子對玄參幼苗生長的影響

本研究對分級后種子的幼苗進(jìn)行了相關(guān)指標(biāo)的測定，不同等級的玄參種子田間試驗(yàn)結(jié)果見表5。從表5明顯看出Ⅰ級種子在田間出苗率，幼苗生長指標(biāo)，壯苗指數(shù)明顯高于Ⅱ級和Ⅲ級種子幼苗，證明了本研究對玄參分級標(biāo)準(zhǔn)有一定的參考價(jià)值。

4 討論

在分級的各項(xiàng)指標(biāo)中，發(fā)芽率最重要，因?yàn)榘l(fā)芽率的大小決定了種子的田間利用價(jià)值，根據(jù)種子的發(fā)芽率計(jì)算田間實(shí)際播種量[7]，作為分級的第一指標(biāo)；千粒重可反映種子大小，飽滿程度和種子成熟度等，玄參種子千粒重受到產(chǎn)地、采收期等客觀因素的影響，采收時(shí)間過早或過晚，均會影響玄參種子成熟度。種子成熟度對其萌發(fā)率及產(chǎn)量均有直接影響，劉心民[8]研究表明玄參種子的萌發(fā)率與成熟度密切相關(guān)。因此，本研究將千粒重作為分級重要的參考指標(biāo)；凈度與發(fā)芽率、發(fā)芽勢的相關(guān)系數(shù)都較高，凈度的高低不是種子生物學(xué)特性所決定的，行政和經(jīng)濟(jì)手段是決定種子凈度高低的主要因素，與種子的發(fā)芽能力無關(guān)。但凈度是種子收購、貯藏中的主要指標(biāo)，發(fā)芽率實(shí)驗(yàn)也是在凈度的基礎(chǔ)上進(jìn)行的，所以在種子質(zhì)量評定時(shí)需要權(quán)衡考慮[9]。生活力雖能反映種子發(fā)芽和出苗期間活性強(qiáng)度，但實(shí)際生產(chǎn)中可操作性差；種子的含水量與發(fā)芽率、發(fā)芽勢、凈度、生活力及千粒重之間沒有相關(guān)性，說明在安全含水量范圍內(nèi)，玄參種子品質(zhì)與含水量不相關(guān)。綜合實(shí)際生產(chǎn)和各指標(biāo)的相關(guān)性分析，把發(fā)芽率、千粒重、凈度作為玄參種子質(zhì)量的重要指標(biāo)。

目前，包括玄參在內(nèi)的絕大部分中藥材種子缺乏相應(yīng)的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，無法對市場上的中藥材種子質(zhì)量進(jìn)行檢驗(yàn)和有效控制。這使得中藥材種子檢驗(yàn)工作無標(biāo)準(zhǔn)可依，種子質(zhì)量控制受到極大的制約。因此，開展中藥材種子檢驗(yàn)規(guī)程和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究是我國中藥材規(guī)范化生產(chǎn)急需解決的重大問題[10]。本研究提供的玄參種子分級標(biāo)準(zhǔn)是在試驗(yàn)研究的基礎(chǔ)上提出的，是玄參生產(chǎn)質(zhì)量管理的重要組成部分。