蒲 銳，萬定榮＊＊，趙百孝，武 娟，史楠楠，黃璐琦，張夢(mèng)娜

（1. 中南民族大學(xué)藥學(xué)院 武漢 430074；2. 北京中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院 北京 100029；3. 中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)臨床基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京 100700）

艾葉是我國傳統(tǒng)的中藥材，也是世界上著名艾灸療法的原材料，具有散寒、溫經(jīng)止血的功效[1]。湖北蘄春縣所產(chǎn)的蘄艾葉為艾葉的道地藥材，是國家地理標(biāo)志保護(hù)產(chǎn)品。其揮發(fā)油、總黃酮及鞣質(zhì)等活性物質(zhì)[2-7]的平均含量均顯著高于其它地區(qū)所產(chǎn)艾葉的平均含量。環(huán)境條件是影響藥材品質(zhì)的重要因素[8-11]，而蘄艾生長(zhǎng)環(huán)境等因素對(duì)其有效物質(zhì)含量和出絨率的影響研究未見報(bào)道。我們通過收集湖北省蘄春縣不同地點(diǎn)、不同環(huán)境的土壤進(jìn)行含水量、有機(jī)質(zhì)含量及pH 值的測(cè)定，并收集了相應(yīng)地點(diǎn)蘄艾葉樣品，對(duì)其主要有效物質(zhì)（揮發(fā)油、總黃酮、鞣質(zhì)）含量及出絨率進(jìn)行測(cè)定比較，還通過HPLC 譜圖分析了不同樣品中幾種有機(jī)酸的含量變化，從而探討了環(huán)境條件對(duì)蘄艾有效物質(zhì)積累及出絨率的影響，以期為蘄艾的合理栽培并生產(chǎn)高品質(zhì)蘄艾葉原材料提供參考。

1 儀器與材料

1.1 主要儀器

UltiMate 3000 型高效液相色譜儀（二極管陣列檢測(cè)器，Chromeleon 色譜工作站，美國戴安公司）；BDS hypersil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm,5μm，賽默飛世爾科技＜中國＞有限公司）；UV-1800PC型紫外-可見分光光度計(jì)（上海美譜達(dá)儀器有限公司）；AB256-S 型1/10 萬電子分析天平（梅特勒-托利多＜上海＞有限公司）；CP214 萬分之一分析天平（奧豪斯儀器有限公司）；KQ5200B 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；HH-4 型水浴鍋（金壇市科興儀器廠）；揮發(fā)油提取器（武漢杰恒達(dá)工貿(mào)有限公司）；85-2數(shù)顯恒溫磁力攪拌器（金壇市科興儀器廠）；PHS-3C 型pH 計(jì)（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）；DF-101S 型集熱式恒溫加熱磁力攪拌油浴鍋（武漢科爾儀器設(shè)備有限公司）。

表1 湖北省不同地點(diǎn)與不同環(huán)境的蘄艾葉樣品信息

1.2 試藥與材料

磷鉬鎢酸試液按照2015 版《中國藥典》四部通則8002下的方法進(jìn)行配制；對(duì)照品芹菜素（批號(hào)111901-201603，純度99.2%）、沒食子酸（批號(hào)110831-201605，純度90.8%）、綠原酸（批號(hào)110753-2011415，純度96.2%），均購自中國食品藥品檢定研究院；對(duì)照品隱綠原酸（批號(hào)wkq18031901）、3,5-二咖啡?？鼘幩幔ㄅ?hào)wkq18041207）、3,4-二咖啡?？鼘幩幔ㄅ?hào)wkq18012408）、4, 5- 二 咖 啡 酰 奎 寧 酸（批 號(hào)wkq18050905）、異澤蘭黃素（批號(hào)wkq16082105），均購自四川省維克奇生物科技有限公司，棕失車菊素（批號(hào)P06J9F63077）購自上海源葉生物科技有限公司，上述對(duì)照品的純度均標(biāo)示大于98.0%；重鉻酸鉀、硫酸亞鐵、濃硫酸、甲醇和其他試劑均為分析純（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；水為超純水。蘄艾樣品共21 份于2017 年5 月27 日采于湖北蘄春縣不同地點(diǎn)與不同環(huán)境（表1），經(jīng)萬定榮教授鑒定，均為菊科植物艾Artemisia argyi Lévl. et Vant.的干燥葉。同時(shí)，采集了每份蘄艾（葉）樣品所處地點(diǎn)的土樣。

2 方法

2.1 土壤水分的測(cè)定

取各新鮮土壤樣品約30 g，精密稱定，參照《中華人民共和國國家環(huán)境保護(hù)標(biāo)準(zhǔn)》土壤干物質(zhì)和水分的測(cè)定“重量法”（HJ 613—2011）規(guī)定的方法進(jìn)行測(cè)定。

2.2 土壤pH值的測(cè)定

按照《中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》“土壤pH的測(cè)定”（NY/T 1377—2007）規(guī)定的方法進(jìn)行測(cè)定。

試樣的制備：用四分法取適量風(fēng)干土壤樣品，剔除土壤以外的侵入體，再將土壤碾碎，過2 mm 孔徑的試驗(yàn)篩，混勻，裝入潔凈土樣袋中備用。

試樣溶液的制備：取上述土樣，約10.0 g，精密稱定，置于50 mL 的高型燒杯中，加水25 mL，密封，用攪拌器劇烈攪拌5 min，靜置2 h，即得。

分析步驟：取上述試樣溶液，充分搖動(dòng)后，依法用pH計(jì)進(jìn)行測(cè)定。

2.3 土壤有機(jī)質(zhì)的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取通過0.25 mm 孔徑試驗(yàn)篩的風(fēng)干土樣0.25 g（精確到0.000 1 g，稱樣量按規(guī)定根據(jù)預(yù)先測(cè)定有機(jī)質(zhì)含量而定），按照《中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》土壤檢測(cè)第6 部分：土壤有機(jī)質(zhì)的測(cè)定（NY/T1121.6—2006）項(xiàng)下方法進(jìn)行測(cè)定。

2.4 揮發(fā)油含量測(cè)定

取各剪碎蘄艾葉樣品（碎末直徑1-2 mm，下同）約40.0 g，精密稱定，參照2015版《中華人民共和國藥典》揮發(fā)油測(cè)定法（中國藥典第四部通則2204）進(jìn)行測(cè)定，其中加入燒瓶中的水的體積為600 mL。

2.5 總黃酮含量測(cè)定

測(cè)定方法：測(cè)定方法通過本課題組實(shí)驗(yàn)而確定，其供試品溶液的制備、測(cè)定波長(zhǎng)、測(cè)定方法均參閱課題組成員的相關(guān)文獻(xiàn)[12]。方法學(xué)考察表明，該方法精密度、重復(fù)性及加樣回收率均符合含量測(cè)定要求，供試品溶液配制后在24小時(shí)內(nèi)測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定。

對(duì)照品溶液的制備：精密稱取芹菜素對(duì)照品10.05 mg，置100 mL 容量瓶中，加70%甲醇適量使溶解，并定容至刻度，搖勻，即得。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：精密量取對(duì)照品溶液0.15、0.4、0.8、1.6、2.4、3.2、4.0 mL，分別置25 mL 量瓶中，加70%甲醇稀釋至刻度，搖勻，以70%甲醇為空白，照紫外-可見分光光度法，在338 nm 處分別測(cè)定吸光度。以吸光度A 為縱坐標(biāo)（Y），對(duì)照品溶液的濃度（μg·mL-1）為橫坐標(biāo)（X），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得回歸方程：Y =0.079 6X + 0.008 8（r=0.999 7），表明在0.598 2-15.951 3μg·mL-1范圍內(nèi)，芹菜素濃度與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

樣品含量測(cè)定：取上述蘄艾葉樣品共21批，剪碎，分別取約1 g，精密稱定，依法制備供試品溶液并進(jìn)行測(cè)定。每份樣品各制成2 份供試液，取平均測(cè)定值作為含量測(cè)定結(jié)果。

2.6 鞣質(zhì)含量測(cè)定

取各剪碎樣品約2 g，精密稱定，按照2015 版中國藥典第四部通則2202 項(xiàng)下的方法進(jìn)行測(cè)定。其中標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備照紫外-可見分光光度法，在760 nm 的波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，沒食子酸的濃度（μg·mL-1）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為Y=0.125 6X+0.038 7，r=0.999 8。結(jié)果表明在0.908-9.08 μg·mL-1范圍內(nèi)，沒食子酸的濃度與吸光度呈良好線性關(guān)系。

2.7 出絨率檢測(cè)

取樣法：從蘄艾葉大樣中抽取160.00 g 初始樣品（除盡雜質(zhì)異物及小枝梗的凈重），通過四分法取樣，最終獲取10.00 g 試驗(yàn)樣品用于出絨率檢測(cè)。每一大樣重復(fù)抽樣檢測(cè)兩次，取平均出絨率作為檢測(cè)結(jié)果。

檢測(cè)方法：將10.00 g 試驗(yàn)樣品用高速粉碎機(jī)（轉(zhuǎn)速24 000 r·min-1）連續(xù)粉碎處理2 min后，置于20目分樣篩中，加蓋反復(fù)過篩，除盡粉末。取出細(xì)絨狀的艾絨，稱重，計(jì)算蘄艾絨所占百分比。取兩份樣品檢測(cè)的平均出絨率作為檢測(cè)結(jié)果。

方法學(xué)初步驗(yàn)證：以上述擬定的出絨率檢測(cè)方法，經(jīng)對(duì)產(chǎn)于湖北蘄春縣的同一艾葉大樣平行取樣重復(fù)檢測(cè)6 次，其各測(cè)定出絨率的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差（RSD）為3.99%，表明擬定的檢測(cè)方法重復(fù)性良好，能可靠用于蘄艾葉出絨率的檢測(cè)。

2.8 樣品HPLC譜圖的比較

色譜條件：色譜柱為BDS Hypersil C18 柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相為乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脫（A：0-18 min、12%→19%，18-30 min、19%→23%，30- 43 min、23%→32%，43-54 min、32%→42%，54-60 min、42%→60%，60-70 min、60%→83%）；流速為0.8 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)為360 nm；柱溫為25 ℃；進(jìn)樣量為10μL。

對(duì)照品溶液的制備：精密稱取綠原酸、隱綠原酸、3,5-二咖啡酰奎寧酸、3,4-二咖啡酰奎寧酸、4,5-二咖啡?？鼘幩?、棕失車菊素、異澤蘭黃素對(duì)照品各適量，置于10 mL量瓶中，以甲醇溶解并定容至刻度，再精密量取1 mL，用甲醇稀釋，即得分別含綠原酸、隱綠原酸、3,5-二咖啡?？鼘幩?、3,4-二咖啡酰奎寧酸、4,5-二咖啡酰奎寧酸、棕失車菊素、異澤蘭黃素35.0、25.0、50.0、40.0、40.0、38.0、40.0μg·min-1的對(duì)照品溶液。

供試品溶液的制備：取剪碎的各艾葉樣品約0.50 g，精密稱定，置100 mL 圓底燒瓶中，加入70%甲醇溶液25 mL，稱定重量，85℃水浴回流1 h，放冷，再稱定重量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液5 mL，置10 mL 容量瓶中，加70%甲醇至刻度，搖勻，用0.22μm 微孔濾膜濾過，即得。

3 結(jié)果與分析

3.1 土壤樣品水分、pH、有機(jī)質(zhì)測(cè)定結(jié)果

按照上述土壤水分、pH、有機(jī)質(zhì)測(cè)定的方法，對(duì)湖北蘄春縣21 批蘄艾（葉）樣品所處地點(diǎn)的土壤樣品進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果見表2。

表2 湖北蘄春縣不同地點(diǎn)及環(huán)境土壤的水分含量、pH值、有機(jī)質(zhì)含量檢測(cè)結(jié)果

3.2 揮發(fā)油、總黃酮、鞣質(zhì)含量及出絨率測(cè)定結(jié)果

按照上述樣品中揮發(fā)油、總黃酮、鞣質(zhì)含量測(cè)定的方法對(duì)21批蘄艾葉樣品進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果見表3。

從檢測(cè)結(jié)果分析，施復(fù)合化肥、日照長(zhǎng)短和土壤水分含量對(duì)蘄艾有效物質(zhì)含量有影響。其中李時(shí)珍醫(yī)藥集團(tuán)院墻內(nèi)的3份施化肥（含N、P、K的復(fù)合肥）與不施化肥的對(duì)照樣品測(cè)定結(jié)果說明：施過化肥的蘄艾樣品揮發(fā)油平均含量比未施化肥的高出17.6%，但總黃酮和鞣質(zhì)的平均含量分別降低28.5%、30.5%，且出絨率平均降低9.2%。說明施用化肥盡管可略提高揮發(fā)油含量，但在整體上對(duì)蘄艾葉質(zhì)量有顯著的不良影響。蘄春縣漕河鎮(zhèn)獨(dú)山村、張榜鎮(zhèn)韓榜村、檀林鎮(zhèn)雷沖村三個(gè)地點(diǎn)蘄艾葉樣品的測(cè)定結(jié)果說明：日照不足的蘄艾葉樣品揮發(fā)油的平均含量比日照充足的高出12.6%，但總黃酮和鞣質(zhì)的平均含量均顯著降低（分別降低23.5%、19.1%），且日照不足環(huán)境下的蘄艾樣品出絨率整體較低，說明日照不足從總體上明顯降低艾葉質(zhì)量。另外通過蘄春縣竹林湖基地、清水河基地、三江村三個(gè)地點(diǎn)水分含量相差顯著的蘄艾葉樣品的測(cè)定結(jié)果說明，土壤水分較少的蘄艾葉樣品揮發(fā)油平均含量比水分充足的高出5.5%，但總黃酮和鞣質(zhì)的平均含量均顯著降低（分別降低21.4%、34.6%），說明水分不足在整體上對(duì)蘄艾葉質(zhì)量有不良影響。

表3 湖北省不同地點(diǎn)、環(huán)境（含施化肥與否）蘄艾葉樣品有效物質(zhì)含量及出絨率測(cè)定結(jié)果

3.3 蘄艾葉品質(zhì)—環(huán)境因素相關(guān)性及差異顯著性分析

采用spss22.0 軟件對(duì)蘄艾葉采樣地點(diǎn)的土壤是否施肥、土壤水分是否充足及日照長(zhǎng)短與相對(duì)應(yīng)的蘄艾葉有效物質(zhì)檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行配對(duì)樣本t 檢驗(yàn)分析，結(jié)果表明：施肥（16、18、20號(hào)）與未施肥（17、19、21號(hào)）樣品的揮發(fā)油、總黃酮、鞣質(zhì)的含量均有顯著性差異（P ＜0.05）；土壤水分充足（3、6、9號(hào)）與土壤水分較少（4、5、8 號(hào)）樣品的總黃酮含量有顯著性差異（P ＜0.05），土壤水分充足與土壤水分較少樣品的揮發(fā)油、鞣質(zhì)的含量也均有明顯差異（P 均接近0.05）；全日照（10、12、14號(hào)）與日照時(shí)數(shù)較短（11、13、15 號(hào)）的樣品中揮發(fā)油、總黃酮、鞣質(zhì)的含量也有差異（P接近0.05）。

此外，采用spss22.0 軟件（除去人為因素施化肥的影響），選取1-15 號(hào)樣品對(duì)各采集點(diǎn)的土壤pH、有機(jī)質(zhì)與相對(duì)應(yīng)的活性物質(zhì)含量檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果表明，蘄艾葉總黃酮和鞣質(zhì)的含量也受土壤pH 值的影響，在蘄春縣酸性和偏酸性土壤pH 值范圍內(nèi)，總黃酮含量與pH 值呈一定的正相關(guān)，鞣質(zhì)的含量與pH值呈顯著的正相關(guān)（P小于0.05）。

3.4 HPLC譜圖比較結(jié)果

將不同環(huán)境的蘄艾葉按2.8 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照2.8 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)分析，分別比較了施復(fù)合化肥（16、18、20 號(hào)）樣品與不施復(fù)合化肥（17、19、21號(hào)）樣品、日照時(shí)數(shù)較長(zhǎng)（10、12、14號(hào)）樣品與日照時(shí)數(shù)較短（11、13、15 號(hào)）樣品、土壤水分較少（4、5、8 號(hào)）樣品與土壤水分充足（3、6、9 號(hào)）樣品的HPLC 譜圖（圖2，圖3，圖4）。結(jié)果表明，三批施復(fù)合化肥樣品的色譜峰面積均低于未施肥樣品（色譜峰的總面積平均降低24.5%），說明使用化肥在總體上降低了譜峰所代表的化學(xué)成分的總量，即降低了蘄艾葉的質(zhì)量；三批日照時(shí)數(shù)較短樣品的色譜峰面積也均低于時(shí)數(shù)較長(zhǎng)的樣品（色譜峰的總面積平均低27.8%），說明栽培于日照不充分的環(huán)境中將在整體上降低蘄艾葉的質(zhì)量。三批土壤水分較少樣品的色譜峰面積也均低于土壤水分較多的樣品（色譜峰的總面積平均低28.4%），說明栽培于土壤水分不充足的環(huán)境中將在整體上降低蘄艾葉的質(zhì)量。利用HPLC 譜圖分析環(huán)境因素對(duì)艾葉相關(guān)成分量的影響，與上述對(duì)主要類型有效物質(zhì)含量測(cè)定的結(jié)果一致。

圖1 蘄艾葉和混合對(duì)照品HPLC譜圖

圖2 蘄艾葉樣品（施肥與未施肥）的HPLC譜圖

圖3 蘄艾葉樣品（不同日照時(shí)數(shù)）HPLC譜圖

圖4 蘄艾葉樣品（土壤水分含量不同）HPLC譜圖

通過與化學(xué)對(duì)照品相對(duì)保留時(shí)間的比對(duì)[13,14]，指認(rèn)出蘄艾葉HPLC 譜圖中7 個(gè)主要色譜峰（圖1），分別為綠原酸(1)、隱綠原酸(2)、3,4-二咖啡?？鼘幩?3)、3,5-二咖啡?？鼘幩?4)、4,5-二咖啡?？鼘幩?5)、棕失車菊素(6)、異澤蘭黃素(7)，其中前種為有機(jī)酸類，后2種為黃酮類。三批施復(fù)合化肥樣品的5種有機(jī)酸色譜峰的總面積均顯著低于未施化肥樣品（色譜峰的總面積平均低36.4%），三批日照時(shí)數(shù)較短樣品的5種有機(jī)酸色譜峰的總面積均明顯低于日照時(shí)數(shù)較長(zhǎng)的樣品（色譜峰的總面積平均低19.5%），三批土壤水分較少樣品的5種有機(jī)酸色譜峰總面積均顯著低于土壤水分充足樣品（色譜峰的總面積平均低26.7%）。說明施用復(fù)合有機(jī)化肥、植株日照時(shí)數(shù)及土壤水分含量不足，均對(duì)蘄艾葉的另一類活性物質(zhì)有機(jī)酸的積累，也都會(huì)產(chǎn)生不利影響。

4 小結(jié)與討論

產(chǎn)于湖北省蘄春縣的蘄艾為國內(nèi)外著名的中藥艾葉的道地藥材。本實(shí)驗(yàn)以采集于蘄春縣不同地點(diǎn)、不同環(huán)境條件下的21批蘄艾樣品，通過對(duì)幾類有效物質(zhì)的含量測(cè)定以及HPLC 指紋圖譜相關(guān)成分（有機(jī)酸）量的分析，結(jié)果表明，在湖北省蘄春縣蘄艾產(chǎn)地范圍內(nèi)，土壤水分、pH值、日照長(zhǎng)短及施化肥與否對(duì)藥用的蘄艾品質(zhì)均有不同程度的影響。施用化肥（含N、P、K）和栽培于日照不足、土壤水分較少的環(huán)境中的蘄艾樣品，分別與不施用化肥和栽培于日照、土壤水分充足環(huán)境中的樣品相比，雖然均能提高蘄艾葉中揮發(fā)油含量，但卻均顯著降低總黃酮、鞣質(zhì)和多種有機(jī)酸的含量，并往往明顯降低出絨率；蘄艾葉鞣質(zhì)和總黃酮的含量隨著土壤pH 值（在酸性范圍內(nèi)）的升高而增加。這說明藥用蘄艾的栽培應(yīng)選擇日照充分、土壤水分較充足及土壤偏酸性的環(huán)境條件。在蘄艾的種植過程中，不可避免地要使用肥料，雖然施用化肥可較大幅度提高其產(chǎn)量，只是若連年施用將導(dǎo)致土壤板結(jié)[15]，最終將降低蘄艾葉產(chǎn)量，甚至無法持續(xù)種植。此外，我們?cè)谠缙诘膶?shí)驗(yàn)研究中，發(fā)現(xiàn)湖北省蘄春縣竹林湖種植基地的蘄艾施用了廄肥和餅肥等有機(jī)肥，所產(chǎn)艾葉不僅產(chǎn)量高，其幾類有效物質(zhì)（揮發(fā)油、總黃酮、鞣質(zhì)）的含量，與國內(nèi)多產(chǎn)地的艾葉樣品相比也是高的或最高的[12]，初步說明施用有機(jī)肥或農(nóng)家肥對(duì)提高蘄艾葉的品質(zhì)和產(chǎn)量都是有益的，值得進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

在藥用方面，蘄艾葉還用來直接提取揮發(fā)油。如果僅僅考慮作為提取揮發(fā)油的原材料，由于酸性或偏酸性的土壤環(huán)境對(duì)蘄艾揮發(fā)油的含量高低沒有明顯影響，蘄艾的種植則可選擇光照不夠充分、適度干燥及排水良好的土壤環(huán)境，栽培中可通過施用有機(jī)肥或農(nóng)家肥以提高產(chǎn)量，新的種植地塊也可在第一年的春季施用少量化肥。