劉 菊，崔 瑛，張紅偉，董玉珍，楊 飛

（1. 鄭州市中醫(yī)院 鄭州 450007；2. 河南中醫(yī)藥大學(xué) 鄭州 450008；3. 河南省食品藥品檢驗(yàn)所 鄭州 450001；4. 鄭州市食品藥品檢驗(yàn)所 鄭州 450007）

心律失常是心血管系統(tǒng)疾病中最為嚴(yán)重的病癥之一。其危害在于它不但可加重原有心臟疾病，而且還可導(dǎo)致患者突然死亡,嚴(yán)重威脅人類健康[1]。在我國(guó)，心血管疾病的病死率始終居于居民死因的前列，而心律失常是最常見(jiàn)和多發(fā)的心血管疾病之一。近年來(lái)，社會(huì)結(jié)構(gòu)變革和自然環(huán)境惡化對(duì)居民健康的影響，使得心律失常的發(fā)病率急劇攀升[2]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)心律失常的治療經(jīng)過(guò)不斷探索與發(fā)展，取得了很大的進(jìn)步，西醫(yī)藥物治療主要以化學(xué)藥物為主，如抗凝劑、β 受體阻滯劑、胺碘酮等?？剐穆墒СＫ幎季哂胁煌潭鹊闹滦穆墒СＷ饔?，包括引起用藥前沒(méi)有的新的心律失常和使原有的心律失常惡化加重，抗心律失常藥物大多有負(fù)性變力性作用，且藥物容易產(chǎn)生耐藥性[3]。中醫(yī)對(duì)心律失常的認(rèn)識(shí)是在整體觀念的指導(dǎo)下，依據(jù)臟腑功能的整體性、經(jīng)絡(luò)氣血的整體性以及“證”的整體性，中醫(yī)會(huì)采用相對(duì)應(yīng)的藥物治療心律失

常，同時(shí)，也采用推拿、針刺、穴位貼敷、埋線等非藥物治療方法進(jìn)行輔助治療，在臨床上達(dá)到了一定的療效，在研究方面也取得了一定的成果，奠定了一定的研究基礎(chǔ)。

黃連為毛茛科植物黃連Coptis chinensis Franch.、三角葉黃連C.deltoidea C.Y.Cheng et Hsiao 或云南黃連C.teeta Wall. 的干燥根莖[4]，又名川連、雞爪連。本品味苦，性寒，歸心、胃、肝、大腸經(jīng)，具清熱瀉火、燥濕解毒之功效。臨床上多用于治療痢疾、急性胃腸炎、慢性腹瀉、呼吸道感染以及各種炎癥,近年研究發(fā)現(xiàn)其在抗腫瘤、抗心律失常、降血糖等方面亦有明顯作用。小檗堿是黃連的主要化學(xué)成分，含量達(dá)5.20%-7.69%，其它化學(xué)成分還有黃連堿、甲基黃連堿、掌葉防己堿（巴馬?。?、棕櫚堿、藥根堿、非洲防己堿、表小檗堿、木蘭花堿和阿魏酸。目前《中國(guó)人民共和國(guó)藥典》收載黃連含量測(cè)定采用一測(cè)多評(píng)法。藥理作用主要有抗病原微生物、降血糖、抗氧化、抑瘤作用、防治動(dòng)脈硬化等[5]。甘松Nardostachys chinensis Batal.系敗醬科甘松屬植物甘松的干燥根及根莖。其主要成分為揮發(fā)油和萜類成分；后者又以倍半萜種類最多，主要為甘松香醇、甘松酮、馬兜鈴?fù)?、廣藿香醇及纈草酮等[6]。目前對(duì)其化學(xué)成分定性定量研究較少。

圖1 鹽酸小檗堿溶液高效液相色譜圖

我院自制制劑黃松膠囊是由黃連、甘松兩味中藥提取加工制成，具有安神定悸，和胃化痰之功。用于痰濁蒙閉心竅所致的各種心律失常。目前黃松膠囊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)比較落后，無(wú)含量測(cè)定項(xiàng)。君藥黃連含多種生物堿，除小檗堿之外，黃連堿、巴馬汀、表小檗堿等含量也較高，特別是表小檗堿是甄別黃連與其它摻假品的特征性成分。如建立外標(biāo)法進(jìn)行含量測(cè)定，鹽酸表小檗堿，鹽酸黃連堿對(duì)照品不易獲得，且成本較高，因此亟需建立一測(cè)多評(píng)法（QAMS）同時(shí)測(cè)定小檗堿、黃連堿、巴馬汀、表小檗堿四個(gè)成分作為指標(biāo)評(píng)價(jià)黃松膠囊的質(zhì)量。本文首次建立一測(cè)多評(píng)法同時(shí)測(cè)定黃松膠囊中4種生物堿成分含量，簡(jiǎn)單易行，準(zhǔn)確度高，質(zhì)量可控?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器、試劑和藥品

1.1 儀器

Angilent1260 高效液相色譜儀，島津LC-2010C 液相 色 譜 儀，色 譜 柱Angilent XDB-C18（5 μm, 4.6 ×250 mm），Thermo C18（5 μm, 4.6 × 250 mm）；Precisa 92SM-202A-DR電子天平。

1.2 試劑

鹽酸小檗堿（批號(hào):110713-201212,含量以86.7%計(jì)）、鹽酸巴馬汀(批號(hào)110732-200506)均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；鹽酸表小檗堿（含量98.8%）、鹽酸黃連堿（含量89.2%）由河南中醫(yī)藥大學(xué)臨床中藥學(xué)科研究室提供；乙腈為色譜純，水為娃哈哈純凈水，其余試劑均為分析純。

1.3 藥品

黃松膠囊（科研自制，批號(hào)：160201；160412；161222）。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取鹽酸表小檗堿、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿適量，加甲醇制成每mL 含3.16、18.11、8.20、5.55 mg 對(duì)照品的溶液。精密量取上述4 種對(duì)照品溶液各1 mL，置50 mL 容量瓶中，加甲醇定容置刻度，為混合對(duì)照品溶液（每mL 含鹽酸表小檗堿、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿分別為63.2、362.2、164.0、111μg）。

2.2 供試品溶液的制備[7-8]

取本品內(nèi)容物0.4 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇-鹽酸（100∶1）混合溶液50 mL，密塞，稱定重量，超聲處理30 分鐘，放冷，再稱定重量，加甲醇補(bǔ)足減失重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.3 陰性溶液的制備

取黃連外的藥材制備成膠囊，取內(nèi)容物再按照供試品相同的方法進(jìn)行處理，制成缺黃連的陰性供試品溶液。

2.4 系統(tǒng)性試驗(yàn)[9-10]

色譜柱Angilent XDB-C18,5 μm,4.6 × 250 mm，乙腈-0.05 mol·L-1磷酸二氫鉀溶液（50:50）（每1000 mL中加十二烷基硫酸鈉0.4 g，再以磷酸調(diào)節(jié)pH 值為4.0）為流動(dòng)相，流速為1 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)為345 nm。

柱溫為室溫。按以上條件，鹽酸小檗堿溶液、混合對(duì)照品溶液、供試品溶液、缺黃連陰性溶液分別進(jìn)樣10μL，理論板數(shù)按鹽酸小檗堿峰計(jì)不低于5000，各組分分離度大于1.5，陰性無(wú)干擾，得色譜分離圖，見(jiàn)圖1、圖2、圖3、圖4。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 線性關(guān)系考察

將混合對(duì)照品溶液依次稀釋15、10、7.5、5、2.5倍，精密吸取上述5 個(gè)濃度對(duì)照品溶各10 μL，按“2.4”項(xiàng)下色譜條件，注入液相色譜儀，記錄峰面積。以濃度（mg·mL-1）為橫坐標(biāo)（X），峰面積（mAU*s）為縱坐標(biāo)（Y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得4 種成分回歸方程及線性范圍見(jiàn)表1。

圖2 混合對(duì)照品溶液高效液相色譜圖

圖3 供試品溶液

圖4 缺失黃連陰性制劑溶液高效液相色譜圖

表1 4種生物堿成分的線性及回歸方程

2.5.2 精密度試驗(yàn)

將4 種對(duì)照品混合溶液連續(xù)進(jìn)樣5 次，記錄峰面積，鹽酸表小檗堿、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿RSD%分別0.20%、0.23%、0.18%、0.10%。

2.5.3 重現(xiàn)性試驗(yàn)

稱取同一批供試品5份，按2.4項(xiàng)方法處理，進(jìn)樣，記錄峰面積，鹽酸表小檗堿、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿RSD%分別為0.89%、0.75%、0.66%、0.88%，重現(xiàn)性較好。

2.5.4 日內(nèi)穩(wěn)定性試驗(yàn)

將同一批供試品，每3h 測(cè)定峰面積一次，記錄峰面積，鹽酸表小檗堿、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿RSD%分別為0.02%、0.12%、0.08%、0.03%，12 h內(nèi)穩(wěn)定。

表2 4中生物堿成分加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果表

表3 不同組分相對(duì)鹽酸小檗堿的校正因子

2.5.5 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的同一批供試品5 份，分別加入一定量的4種對(duì)照品溶液，按上述2.2項(xiàng)方法處理測(cè)定，進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，計(jì)算回收率，鹽酸小檗堿、鹽酸表小檗堿、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀的回收率分別為98.57%、99.78%、99.67%、99.95%，RSD% 分 別 為0.45%、0.69%、0.69%、1.04%（表2）。

2.6 相對(duì)校正因子的確定

2.6.1 相對(duì)校正因子計(jì)算[11-14]

取2.1 項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣2、4、6、8、10、15、20 μL，以鹽酸小檗堿（D）為內(nèi)標(biāo)物，分別計(jì)算鹽酸表小檗堿（A）、鹽酸黃連堿（B）、鹽酸巴馬?。–）的相對(duì)校正因子，結(jié)果見(jiàn)表3。

表4 不同儀器和色譜柱相對(duì)校正因子

表5 不同儀器和色譜柱測(cè)定

表5 不同儀器和色譜柱測(cè)定

?

表6 一測(cè)多評(píng)法（QAMS）與外標(biāo)法測(cè)定4種生物堿成分含量（mg·g-1）比較

2.6.2 相對(duì)校正因子重現(xiàn)性[11-14]

考察了島津LC-2010C、Aglient1260 型高效液相色譜儀和2 種色譜柱，鹽酸小檗堿對(duì)鹽酸表小檗堿（A）、鹽酸黃連堿（B）、鹽酸巴馬汀（C）的相對(duì)校正因子基本一致。RSD小于2%，結(jié)果穩(wěn)定可控（表4）。

2.6.3 待測(cè)組分峰的定位[11-15]

利用相對(duì)保留值（rk/s）定性，測(cè)定鹽酸表小檗堿（A）、鹽酸黃連堿（B）、鹽酸巴馬?。–）、鹽酸小檗堿（D）結(jié)果見(jiàn)表5，RSD%≦2%，表明利用rk/s進(jìn)行峰定位可行。rk/s=tk/ts（k是待測(cè)組分，s是內(nèi)標(biāo)物）。

2.7 一測(cè)多評(píng)法（QAMS）與外標(biāo)法測(cè)定結(jié)果比較

取3 批黃松膠囊內(nèi)容物，每批取3 份樣，按照供試品制備方法制備，分別注入液相色譜儀，測(cè)定鹽酸表小檗堿、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿的含量；并運(yùn)用鹽酸小檗堿（D）對(duì)鹽酸表小檗堿（A）、鹽酸黃連堿（B）、鹽酸巴馬?。–）的相對(duì)校正因子，計(jì)算各組分的含量。將一測(cè)多評(píng)法（QAMS）與外標(biāo)法測(cè)得值進(jìn)行比較（表6）。所得值RSD%≦3%。表明一測(cè)多評(píng)可用于黃松膠囊4種生物堿成分的含量測(cè)定。

3 討論

黃松膠囊由甘松、黃連2 味藥材制備而成，目前對(duì)甘松研究較少，而黃連的含量測(cè)定方法較為成熟，易于控制，黃連藥材、飲片和成方制劑的質(zhì)量控制多以單指標(biāo)（小檗堿）來(lái)控制其質(zhì)量。已知小檗堿在很多植物中均存在，且含量較高，如三顆針、黃柏等，另外尚有許多不法廠商在其不合格的產(chǎn)品中非法添加小檗堿以次充佳，因此選擇適宜的指標(biāo)對(duì)于保證黃連及其相關(guān)成藥的質(zhì)量至關(guān)重要[10]。筆者選擇測(cè)定君藥黃連中4 種生物堿成分進(jìn)行質(zhì)量控制。外標(biāo)法測(cè)得4 種生物堿成分含量，需要對(duì)照品較多，成本高，并且目前鹽酸黃連堿和鹽酸表小檗堿不易獲得，因此建立一測(cè)多評(píng)法，為日后質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立及普及提供試驗(yàn)基礎(chǔ)。

測(cè)定波長(zhǎng)選擇參照2015年版《中國(guó)人民共和國(guó)藥典》黃連含量測(cè)定條件，將供試品進(jìn)行處理，在紫外分光光度計(jì)下進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，溶液在345 nm 處有最大吸收，因此確定測(cè)定波長(zhǎng)為345 nm。

提取條件的優(yōu)化與確定參照2015年版《中國(guó)人民共和國(guó)藥典》，采用超聲15 min、30 min、45 min、回流1 h、2 h幾種方式對(duì)供試品進(jìn)行提取，測(cè)定，超聲時(shí)間短，且效果優(yōu)于回流，且超聲45 min與30 min區(qū)別不顯著，因此采用超聲30 min作為提取方法。

傳統(tǒng)多指標(biāo)同步質(zhì)量控制必然要求眾多中藥對(duì)照品，為實(shí)現(xiàn)在中藥對(duì)照品緊缺、成本高昂的條件下的多指標(biāo)同步質(zhì)量控制，王智民等于2006年首次提出了一測(cè)多評(píng)法(quantitative analysis of multicomponents by single-maker，QAMS)來(lái)解決此問(wèn)題。該法通過(guò)采用一種內(nèi)參物檢測(cè)多種組分，節(jié)約成本、結(jié)果準(zhǔn)確，已得到廣泛認(rèn)可和應(yīng)用，并收載于2010 年版《中國(guó)人民共和國(guó)藥典(一部)》[16]。一測(cè)多評(píng)法（QAMS）借鑒經(jīng)典的內(nèi)標(biāo)法、校正因子法、主成分自身對(duì)照法和紫外百分吸收系數(shù)法的優(yōu)勢(shì)，在缺少對(duì)照品的情況下，利用成分間的相對(duì)校正因子實(shí)現(xiàn)多成分的測(cè)定，對(duì)中藥的質(zhì)量進(jìn)行控制，該方法方便、快速、廉價(jià)，大幅度降低了檢測(cè)成本和時(shí)間，提高了工作效率和方法的實(shí)用性，能夠更有效、更全面、更準(zhǔn)確地控制中藥質(zhì)量，將是中藥多組分同步定量的發(fā)展方向[17-24]。自2006 年提出一測(cè)多評(píng)法之后，目前已經(jīng)在柴胡、秦皮、穿心蓮、黃芪、天麻等40種以上的藥材多指標(biāo)定量質(zhì)量控制中得到應(yīng)用研究。但是中藥制劑中應(yīng)用還較少。

中藥化學(xué)成分非常復(fù)雜，在不同色譜條件下有不同的色譜峰，在同一色譜條件下，其色譜峰的數(shù)量、出峰時(shí)間及峰形等也受色譜柱、儀器及溶劑系統(tǒng)等多種因素影響，因此如何將待測(cè)色譜峰準(zhǔn)確定位，是一測(cè)多評(píng)方法能否成功應(yīng)用的關(guān)健技術(shù)，需要進(jìn)行深入廣泛的研究?！耙粶y(cè)多評(píng)法”雖然已經(jīng)在部分化合物的檢測(cè)中得到了成功應(yīng)用，但其用于中藥多指標(biāo)質(zhì)量評(píng)價(jià)與控制才剛剛開(kāi)始，相對(duì)較正因子還面臨在同結(jié)構(gòu)和不同結(jié)構(gòu)類型化合物及不同色譜條件之間的普適性問(wèn)題，以及如何準(zhǔn)確定位待測(cè)色譜峰的難題，未來(lái)還需更深入的開(kāi)展研究[25]。

本文首次建立一次多評(píng)法同時(shí)測(cè)定黃松膠囊中4種生物堿成分含量，線性、分離度較好，陰性無(wú)干擾，重現(xiàn)性、精密度、耐用性均較好，可有效地用于黃松膠囊的質(zhì)量控制。