黃 平，毛坤軍＊，周慧云，張 莉，周興卓

（1. 江西醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校藥學(xué)系 上饒 334000；2. 青島大學(xué)附屬醫(yī)院 青島 266000）

斷節(jié)參系蘿藦科（Asclepiadaceae）鵝絨藤屬（Cynanchum Linn）植物昆明杯冠藤Cynanchum wallichii Wight 的根，又名青洋參，對(duì)節(jié)參。主要分布于我國(guó)四川、云南、貴州以及廣西等地。具有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨之功效，主要用于治療風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎及腎虛腰痛、病后體虛、跌打損傷等[1]。當(dāng)前，斷節(jié)參的藥用主要作為著名成藥“虎力散”的組成藥，其他藥用更多憑借的是民間長(zhǎng)期藥用經(jīng)驗(yàn)。

為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用斷節(jié)參藥材，本課題組前期對(duì)斷節(jié)參根的化學(xué)成分進(jìn)行了系統(tǒng)研究，從中分離得到系列C21甾體苷類化合物和苯乙酮類化合物[2]，并建立了斷節(jié)參中5 個(gè)苯乙酮類化合物的HPLC 含量測(cè)定方法[3]，初步建立了斷節(jié)參的質(zhì)量控制方法。但隨著中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的逐步提高和規(guī)范，2010 版《中國(guó)藥典》編制大綱中提出中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)“逐步由單一指標(biāo)性成分定性定量測(cè)定，向活性、有效成分及生物測(cè)定的綜合檢測(cè)過(guò)渡，向多成分和指紋或特征圖譜整體質(zhì)量控制模式轉(zhuǎn)化”的指導(dǎo)思想[4]，因此，進(jìn)一步研究斷節(jié)參藥材的HPLC對(duì)其質(zhì)量控制具有重要意義。

本文對(duì)采自云南、貴州、廣西3個(gè)產(chǎn)地的斷節(jié)參藥材進(jìn)行了HPLC 指紋圖譜研究，建立了分離度、重現(xiàn)性均較好的HPLC 指紋圖譜方法，為建立全面、整體的斷節(jié)參藥材質(zhì)量控制方法提供了依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters2695高效液相色譜儀：包括waters e2489檢測(cè)器，Empower3 工作站（美國(guó)Waters 公司）；CPA225D型電子天平（德國(guó)賽多利斯）；KQ-500DE 型超聲波清洗機(jī)（昆山市超聲儀器有限公司）；純水儀（易普易達(dá)科技有限公司）；《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》軟件2012版（國(guó)家藥典委員會(huì)）。

1.2 試藥

對(duì)照品：2,5-二羥基苯甲酸甲酯、白首烏二苯酮、2,4-二羥基苯乙酮為實(shí)驗(yàn)室自制，經(jīng)HPLC 分析純度均大于98%；斷節(jié)參藥材（S1：云南120914；S2：云南110723；S3：云南131212；S4：云南140726；S5：廣西140309；S6：廣西121220；S7：貴州131102；S8：貴州140924；S9：貴州130812）；色譜甲醇購(gòu)自Merck 公司；磷酸、分析甲醇為北京化工產(chǎn)品；水為去離子水。

表1 洗脫程序

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Hanbon-C18色譜柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm）；流動(dòng)相A：甲醇，流動(dòng)相B：0.5%乙酸水溶液；流速1.0 mL·min-1；柱溫30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為265 nm；進(jìn)樣量10μL。梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取2,5-二羥基苯甲酸甲酯、白首烏二苯酮、2,4-二羥基苯乙酮對(duì)照品適量，加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為96.4、80.3、68.1μg·mL-1的混合對(duì)照品溶液，搖勻，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備

取斷節(jié)參根藥材，粉碎，過(guò)篩，稱取1.0 g，置50 mL三角瓶中，精密量取甲醇25 mL，稱重，超聲處理30 min，稱重，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度實(shí)驗(yàn)

取批號(hào)121220的斷節(jié)參藥材，按“2.2.2”的方法制備供試品溶液，按“2.1”的色譜條件檢測(cè)。連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖。以2,5-二羥基苯甲酸甲酯為參照峰，計(jì)算出16 個(gè)共有色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD 值＜0.5%，相對(duì)峰面積的RSD 值＜1.8%，表明儀器的精密度良好。

2.3.2 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取批號(hào)121220 的斷節(jié)參藥材6 份，按“2.2.2”的方法制備供試品溶液，按“2.1”的色譜條件檢測(cè)。以2,5-二羥基苯甲酸甲酯為參照峰，計(jì)算出16個(gè)共有色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD 值＜1.0%，相對(duì)峰面積的RSD值＜2.5%，表明本方法的重復(fù)性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取批號(hào)121220的斷節(jié)參藥材，按“2.2.2”的方法制備供試品溶液，按“2.1”的色譜條件分別在0、2、4、8、12、24 h檢測(cè)，記錄色譜圖。以2,5-二羥基苯甲酸甲酯為參照峰，計(jì)算出16 個(gè)共有色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD 值＜1.6%，相對(duì)峰面積的RSD 值＜1.9%，表明本方法的穩(wěn)定性良好。

2.4 HPLC指紋圖譜的生成及共有峰的指認(rèn)

2.4.1 HPLC指紋圖譜的生成

取不同批次樣品適量，按“2.2.2”的方法制備供試品溶液，按“2.1”的色譜條件檢測(cè)，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2012 版）對(duì)9 批樣品的HPLC圖譜進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)圖1。結(jié)果表明，9 批樣品的HPLC 圖譜共有特征峰16 個(gè)，其中6 號(hào)色譜峰的峰形好、分離度高、含量高，選擇作為參照峰。

2.4.2 共有峰的指認(rèn)

取混合對(duì)照品溶液和供試品溶液，注入HPLC 分析，結(jié)果如圖2。結(jié)果表明，共有峰中4、6、9 分別指認(rèn)為2,5-二羥基苯甲酸甲酯、白首烏二苯酮和2,4-二羥基苯乙酮。

2.4.3 相似度與各共有峰相關(guān)數(shù)據(jù)分析

采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2012版）對(duì)9 批樣品的HPLC 圖譜進(jìn)行比較分析。結(jié)果得到9批樣品的HPLC圖譜相似度均＞0.91，詳見(jiàn)表1。

3 討論

3.1 提取方法的選擇

本試驗(yàn)比較了不同提取溶劑（甲醇、乙醇）、提取方法（超聲、回流）、提取時(shí)間（15、30、60 min）、料液比（1∶10、1∶25、1∶50）。以出峰數(shù)、各峰面積大小及分離度為評(píng)價(jià)指標(biāo)。結(jié)果顯示以25 倍量的甲醇為提取溶劑，超聲提取30 min時(shí)提取效率最佳。

3.2 色譜條件的選擇

圖1 9批斷節(jié)參藥材的指紋圖譜

圖2 混合對(duì)照品溶液和供試品溶液HPLC分析

據(jù)報(bào)道，斷節(jié)參中主要含有C21甾體皂苷和二苯酮類成分[5]，通過(guò)全波長(zhǎng)掃描，發(fā)現(xiàn)在265 nm波長(zhǎng)下峰數(shù)多、峰型好，故選擇265 nm 為檢測(cè)波長(zhǎng)；流動(dòng)相比較了乙腈-水、甲醇-水、甲醇-酸水，結(jié)果顯示在甲醇-酸水條件下，峰型好，基線平，各色譜峰分離度較好。

3.3 參照峰的選擇

通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)指認(rèn)出6 號(hào)峰為白首烏二苯酮，藥理活性研究表明，白首烏二苯酮具有神經(jīng)保護(hù)和細(xì)胞損傷保護(hù)作用[6]，常作為中藥及其制劑含量測(cè)定的指標(biāo)性成分[7-9]，本試驗(yàn)圖譜中白首烏二苯酮保留時(shí)間穩(wěn)定，峰面積較大，與前后色譜峰分離度較好，故選為參照峰。

斷節(jié)參藥材在《云南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》和《紅河中草藥》中均有記載，但均未建立質(zhì)量控制方法，鑒于斷節(jié)參藥材與近緣種的隔山消、青陽(yáng)參等藥材相似[10]，且部分主要有效成分種類相同，單一的指標(biāo)性成分含量測(cè)定無(wú)法完全鑒別不同藥材或者同一藥材不同產(chǎn)地之間的差異，容易出現(xiàn)使用混亂現(xiàn)象，影響正常用藥的療效和安全性。本試驗(yàn)建立了簡(jiǎn)單可行、穩(wěn)定可靠、專屬性強(qiáng)、重復(fù)性好的斷節(jié)參HPLC 指紋圖譜基礎(chǔ)，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》對(duì)9批不同產(chǎn)地藥材進(jìn)行分析，確定了16 個(gè)共有峰，指認(rèn)出2,5-二羥基苯甲酸甲酯、白首烏二苯酮、2,4-二羥基苯乙酮3個(gè)特征峰，相似度＞0.91。所建立的HPLC 指紋圖譜可以結(jié)合含量測(cè)定，進(jìn)一步提高和完善斷節(jié)參藥材的質(zhì)量控制方法。